武釗 黃偉青 文銳玲 黃瑞嬌 郭蘭英 洪妙玲 劉佩儀

改良二血管阻斷加低血壓法制作大鼠全腦缺血再灌注模型

武釗 黃偉青 文銳玲 黃瑞嬌 郭蘭英 洪妙玲 劉佩儀

目的探討二血管阻斷加低血壓法建立大鼠全腦缺血再灌注模型制作方法的改良，以增加鑄模的成功率。方法21只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組16只，對(duì)照組5只。實(shí)驗(yàn)組采用改良二血管加低血壓法制模，對(duì)照組不做任何處理;對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出存活例數(shù)和死亡例數(shù)之后開顱取大腦組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查，再根據(jù)檢查結(jié)果統(tǒng)計(jì)出造模成功率。結(jié)果16只大鼠中均無死亡現(xiàn)象，2只缺血效果不佳，造模成功率87.5%。經(jīng)HE染色后可觀察到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比腦組織出現(xiàn)大量神經(jīng)元壞死，胞漿濃縮，核固縮現(xiàn)象。結(jié)論改良的二血管阻斷加低血壓法可以有效的降低造模的死亡率，能夠較好的建立大鼠全腦缺血再灌注模型，對(duì)腦復(fù)蘇的進(jìn)一步研究提供良好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

二血管阻斷加低壓法;全腦缺血再灌注模型;有創(chuàng)血壓

目前針對(duì)心肺腦復(fù)蘇的保護(hù)機(jī)制及其方法的研究越來越得到重視，通過全腦缺血再灌注模型模擬心跳驟停，而建立有效的、穩(wěn)定的全腦缺血再灌注模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)廣泛采用的是Pulsinelli四血管閉塞法制模［1］，但是其制模過程復(fù)雜、成模效果差及死亡率高。為提高制模的成功率本實(shí)驗(yàn)參照國外推薦的二血管阻斷法加低血壓法［2］建立缺血模型，并在原有基礎(chǔ)上融入靜脈留置針插管技術(shù)［3］進(jìn)行改良，制模的成功率有了較大的提高，為進(jìn)一步的深入研究提供良好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 分組與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康的成年SPF級(jí)SD大鼠21只，雌雄不限，體質(zhì)量230～280g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組16只與對(duì)照組5只。

1.1.2 材料 BL-420生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)由四川泰盟科技有限公司生產(chǎn)、一次性靜脈留置針(規(guī)格24G×3/4，0.7×19mm)由貝朗醫(yī)療上海國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)、微型鋼絲止血夾由廣州祥鴻醫(yī)療設(shè)備有限公司提供;三通管、連接器等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.12 %戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，取仰臥位固定。用手術(shù)刀切開右側(cè)股動(dòng)脈處皮膚，在切口處可看見神經(jīng)與股動(dòng)、靜脈伴行，白色為神經(jīng)、鮮紅色為股動(dòng)脈、暗紅色為股靜脈。準(zhǔn)確分離股動(dòng)脈后以絲線結(jié)扎遠(yuǎn)心端，再穿2根線備用。待股動(dòng)脈充盈10～15min。滴加生理鹽水以保持組織濕潤。

1.2.2 頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后穿線備用。

1.2.3 待股動(dòng)脈充盈后，用微型動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈近心端，采用靜脈留置針行動(dòng)脈插管，后以絲線固定，將留置針和已充滿肝素的三通管、連接管與BL-420F生物機(jī)能記錄系統(tǒng)連接。撤下動(dòng)脈夾，通過三通管注射肝素150IU/kg達(dá)到全身肝素化。

1.2.4 保證股動(dòng)脈到壓力傳感器的接頭相通連，通過生物機(jī)能記錄系統(tǒng)監(jiān)測動(dòng)脈血壓。通過三通管回抽血液至平均動(dòng)脈壓達(dá)30～40mm Hg，然后用微型動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，進(jìn)入缺血期，并觀察眼球顏色變化及呼吸狀況。

1.2.5 缺血15～25min后移去微型動(dòng)脈夾去除雙側(cè)頸總動(dòng)脈的夾閉，回輸血液，此為再灌注期，本實(shí)驗(yàn)再灌注期時(shí)間為120min。

1.2.6 斷頭后開顱取大腦組織置于4%多聚甲醛液中固定。將大腦頭頂前后按1∶3∶1的比例沿冠狀面切為三分，取中間的3/5用來制作石蠟切片;用蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組頂葉皮層和海馬區(qū)的形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組16只大鼠無一死亡，14只鑄模成功，2例成模效果不佳，成功率為87.5%。

2.2 大腦組織外管病理變化 對(duì)照組大鼠腦組織無腫脹，腦溝腦回清晰，皮層顏色較紅潤;淺表血管豐富，充盈好，鮮紅，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織有明顯腫脹，腦溝腦回表淺，皮層顏色蒼白。表面血管塌陷，血流少。其中部分出現(xiàn)血液無復(fù)流的現(xiàn)象。如圖1-2。

圖1 對(duì)照組大鼠腦組織

圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織

2.3 大腦組織顯微鏡下的病理變化 經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織及神經(jīng)元細(xì)胞。對(duì)照組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列規(guī)則、整齊，胞漿豐富，核呈圓形，核仁清楚;而實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織病理改變明顯，可見大量神經(jīng)元變性壞死，排列紊亂，神經(jīng)元胞漿濃縮，胞核固縮，核仁不清。

圖6 實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞(HE染色，400×)

圖5 對(duì)照組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞(HE染色，400×)

3 討論

由于心臟驟停而引起的腦組織缺血缺氧損傷嚴(yán)重的威脅人類健康，因此相關(guān)研究也引起了專家學(xué)者的重視。目前文獻(xiàn)報(bào)道大多以腦的急性缺血再灌注為實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)［4］，如何建立有效、可行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪沁M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)選用由Smith等［5］提出的二血管阻斷加低血壓法制模，并在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新改進(jìn)，融入靜脈留置術(shù)與三通管，解決了傳統(tǒng)方法的以下問題:1.由于需要監(jiān)測血壓，所以必須行動(dòng)脈插管術(shù)，但由于大鼠血管細(xì)小、管壁薄等特點(diǎn)，傳統(tǒng)方法使用頭皮針時(shí)，在進(jìn)針過程中針尖過于鋒利，很容易出現(xiàn)血管穿破、斷裂的現(xiàn)象;而本實(shí)驗(yàn)選用靜脈留置針，由于其特殊的構(gòu)造(針套、外套管、針芯和肝素帽四個(gè)組成部分)可有效的避免類似意外的發(fā)生。在進(jìn)針后4～5mm處即可把內(nèi)針芯拔掉，進(jìn)行結(jié)扎固定。2.在成功建立動(dòng)脈插管后，對(duì)頸靜脈進(jìn)行血液回抽以及頸動(dòng)脈夾閉時(shí)，大鼠麻醉如果不是非常完全，很可能出現(xiàn)由于大鼠掙扎而導(dǎo)致插管與動(dòng)脈結(jié)扎處的結(jié)扎線松動(dòng)致動(dòng)脈插管滑出或插破血管等意外;而采用靜脈留置針，其插入血管內(nèi)的部分為橡膠套，質(zhì)地柔軟、圓鈍，不易松動(dòng)或插穿血管。3.傳統(tǒng)的方法是做頸靜脈的插管抽放血液，這樣增加一條血管的損傷無疑會(huì)加大對(duì)大鼠自身的傷害，在加上大鼠血管插管本身就具有相當(dāng)?shù)碾y度，如此就進(jìn)一步增添了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性;本實(shí)驗(yàn)則選擇引入三通管，由三通管連接生物換能器、留置針、注射器，通過三通管實(shí)現(xiàn)血液的抽放、回輸以及血壓的監(jiān)測。

近年來，出現(xiàn)了多種針對(duì)建立全腦缺血再灌注模型的實(shí)驗(yàn)方法，包括:四血管阻斷法、頸動(dòng)脈負(fù)壓分流法、三血管阻斷法、二血管阻斷加低血壓法、改良的Pulsinelli四血管閉塞法等，每種方法都具有各自的優(yōu)勢與不足，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)選用的二血管阻斷加低壓法具有手術(shù)過程簡單、成模效率高、易于建立再灌注、更符合血液流變學(xué)的要求等特點(diǎn)，除此外各鼠出現(xiàn)腦梗死范圍也較一致，故常用于模擬臨床上休克、心功能不全、腦血管嚴(yán)重狹窄或阻塞合并血液低灌注引起的腦循環(huán)障礙造成不同程度的腦組織缺血損傷。對(duì)探討缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)理，評(píng)價(jià)抗腦缺血藥物的療效有較高的價(jià)值［6］。

本研究實(shí)驗(yàn)組16只大鼠無一例死亡，僅2例制模效果不佳，造模成功率達(dá)87.5%。觀察其結(jié)果可較好地模擬臨床上因心臟驟停造成的全腦缺血損傷和循環(huán)抑制導(dǎo)致的大腦低灌注狀態(tài)。

以上研究結(jié)果表明，改良的二血管阻斷加低壓法建立全腦缺血再灌注模型有較高的成功率，并且操作簡單、重復(fù)性性好，可為腦缺血的深入研究提供良好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］PulsinelliWA，JamesB，BrierlyM.A newmodelofbilateral ischemia ln the unanesthetized rat.Stroke，1979，10(3):267-272.

［2］周光新，高誠，徐平.人類疾病動(dòng)物模型復(fù)制方法學(xué).上海:上?？萍嘉墨I(xiàn)技術(shù)出版社，2008:160.

［3］梁成結(jié)，朱志榮，謝文鋒，等.用靜脈留置針插大鼠股動(dòng)脈建立有創(chuàng)監(jiān)測血壓模型.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010，10(7):794-796.

［4］Hidenori Endo，Hiroshi Kamada，Chikako Nito，et al.Mitochondrial Translocation of p53Mediates Release of Cytochrome c and Hippocampal CA1Neuronal Death after Transient Global Cerebral Ischemia in Rats.J Neurosci，2006，26(30):7974-7983.

［5］Smith M L，Bendek G，Dahlgren N，et al.Models for studyinglongterm recovery following forebrain ischemia in the rat.2.A 2-vessel occlusion model.Acta Neurol Scand，1984，69(6):385.

［6］張綦慧，張?jiān)蕩X，陳志剛，等.腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯窟M(jìn)展.遼寧中醫(yī)雜志，2001，37(8):1618-1619.

Improvement of two vessel occlusion plus hypotension method in global brain ischemia model of rats

WU Zhao，HUANG Wei-qing，WEN Rui-ling，et al.The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510288，China

ObjectiveTo establish the global cerebral ischemia/reperfusion model by the means of two vessel occlusion add hypotension，study changes of the global cerebral structure in rats.To provide conditions for the research of further nerve protection in the recovery of brain.MethodsEstablish the global cerebral ischemia-reperfusion model in 16SD rats by two-vessel occlusion plus hypotension.Calculate the number of alive cases and death cases，and make a craniotomy for cerebral tissue from morphological observation at the end of the experiment.Results14rats modeling success of the 16rats，whose success rate was 87.5%.Obvious pathological lesions of nerve cells including neuronal necrosis，concentrated neuronal cytoplasma and karyopycnosis are observed in global cerebral ischemia-reperfusion rats.ConclusionThe two vessel occlusion plus hypotension method has a steady effect and a lower mortality of modeling.It can better establish global cerebral ischemia/reperfusion model of in rats，which can provide a good experimental basis for the recovery of the brain research.

Two vascular occlusion;The global cerebral ischemia/reperfusion;Invasive blood pressure monitoring

廣州市大學(xué)生科技創(chuàng)新實(shí)踐項(xiàng)目基金與廣州市大學(xué)生特色項(xiàng)目基金(項(xiàng)目編號(hào):2011-06)

510120廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

黃偉青