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        新型黑素細(xì)胞涂布法移植卡波姆膠載體制備研究

        2012-08-27 09:42:20魯嚴(yán)周梅華李雪吳迪王大光朱文元
        關(guān)鍵詞:卡波姆增殖率黑素細(xì)胞

        魯嚴(yán),周梅華,李雪,吳迪,王大光,朱文元

        (南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南京 210029)

        自體黑素細(xì)胞移植是一種常用的治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的外科療法,該療法原理是將自身正常表皮的黑素細(xì)胞通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增后移植到白癜風(fēng)皮損處,使此處黑素細(xì)胞得以補(bǔ)充、成活,從而在皮損處產(chǎn)生色素。以往該法因細(xì)胞懸液滴種時(shí)常因受植部位、體位的變化,常常不能均勻分布,復(fù)色效果會(huì)受到影響,我們擬研制一種以卡波姆(carbomer)膠為基質(zhì)的載體,克服以上缺點(diǎn),可以用于黑素細(xì)胞涂布法移植,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料 卡波姆940購(gòu)自美國(guó)Noveon公司,Ham F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶、分散酶(dispase enzyme)購(gòu)于美國(guó) Gibco 公司,geneticin(G418)、左旋多巴(Laevodopa,L-DOPA)、12-0-十四酰佛波醇-13-乙酸酯(12-0-Tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA)、 噻 唑 藍(lán) [3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT]均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)家兔由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

        1.2 方法

        1.2.1 黑素細(xì)胞培養(yǎng) 標(biāo)本來自我院泌尿外科健康男性包皮環(huán)切術(shù)后丟棄表皮組織。按照Swope等的方法[1],去除包皮的皮下組織,并剪成小皮片,經(jīng)Dispase酶4℃消化分離表真皮,表皮經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后獲得單細(xì)胞懸液,接種于含常規(guī)黑素細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育。6 h后換液1次去除未貼壁細(xì)胞,48 h后改用不含geneticin的培養(yǎng)基,3天后換液,加入含40 μg/L TPA的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿70%~80%時(shí),用2.5 g/L胰酶消化傳代。黑素細(xì)胞鑒定采用 HMB45(human melanoma black-45)和馬森卡塔納氏(Masson-Fontana)染色。

        1.2.2 卡波姆膠半固體培養(yǎng)基的配置 稱取卡波姆9 405 g,與500 mL含TPA的培養(yǎng)基混合均勻,即得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%卡波姆940黑素細(xì)胞載體膠液,注意配制時(shí)將卡波姆940干細(xì)粉分次撒于培養(yǎng)基液面上,使其充分溶脹,避免結(jié)塊。測(cè)定PH,10 mol/L NaOH調(diào)PH至6.5呈凝膠狀。

        1.2.3 卡波姆膠對(duì)黑素細(xì)胞毒性和增殖的影響 (1)對(duì)黑素細(xì)胞成活率的影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑素細(xì)胞,以濃度5×105/mL 1mL接種于6孔板內(nèi),加入1%卡波姆940黑素細(xì)胞載體膠液進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。5%CO237℃分別培養(yǎng) 1 h,3 h,6 h,12 h,24 h及36 h后2 500轉(zhuǎn)/min離心15 min收集細(xì)胞,TPA黑素細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次,常規(guī)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞成活率。(2)對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑素細(xì)胞,以濃度5×105/mL 200 μL接種于96孔板內(nèi),加入1%卡波姆940黑素細(xì)胞載體膠液進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)分別設(shè)常規(guī)黑素細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)照。分別培養(yǎng) 1 h,3 h,6 h,12 h,24 h 及 36 h 后2 500轉(zhuǎn)/min離心15 min,吸棄卡波姆膠后換為常規(guī)黑素細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔再加入MTT液(5 g/L)20 μL,充分混勻繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清液,加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL,振蕩10 min左右;置酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(A),細(xì)胞增殖率用藥物處理組A值/空白對(duì)照組A值的百分?jǐn)?shù)表示。

        1.2.4 卡波姆膠對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響 Transwell培養(yǎng)板的小室由帶8.0 μm孔徑微孔的聚碳酸酯膜分成上下2室,該膜必須于試驗(yàn)前1天用含有5 μg纖維連接蛋白的黑素細(xì)胞培養(yǎng)液500 μL包被,室溫過夜晾干。將1%卡波姆940黑素細(xì)胞載體膠液與黑素細(xì)胞(5×105/mL)混合凝膠加于上室(聚碳酸酯膜上),并設(shè)空白對(duì)照,分別培養(yǎng)6 h,12 h,24 h取出聚碳酸酯膜并用甲醇固定,HE染色,膜上層(未遷移到下層)的黑素細(xì)胞及凝膠用棉拭子輕輕擦去,高倍鏡下隨機(jī)取4個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)通過8.0 μm孔徑微孔膜遷移到膜下層的黑素細(xì)胞。

        1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 卡波姆膠對(duì)黑素細(xì)胞毒性和增殖的影響 在1%卡波姆膠作用黑素細(xì)胞 1,3,6,12,24 及 36 h后,黑素細(xì)胞的成活率和增殖率分別與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1、表1。

        表1 卡波姆膠對(duì)黑素細(xì)胞成活率和增殖率的影響 (n=4,±s)

        表1 卡波姆膠對(duì)黑素細(xì)胞成活率和增殖率的影響 (n=4,±s)

        注:與對(duì)照組比較,a:P<0.05,b:P<0.01。

        組別對(duì)照組1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 36 h細(xì)胞成活率(%)100 98.79±1.10 97.84±1.66 97.65±1.91 97.03±3.17 96.75±2.62 94.39±4.61細(xì)胞增殖率(%)100 96.35±2.40 95.68±2.91 94.24±3.71 93.90±3.94 93.66±4.33 92.79±4.84

        2.2卡波姆膠對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響 1%卡波姆膠作用6 h時(shí)分別與對(duì)照組和其他時(shí)間組比較,黑素細(xì)胞的遷移受到抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);1%卡波姆膠作用12 h、24 h分別與對(duì)照組比較,黑素細(xì)胞的遷移率無明顯差別(P>0.05);1%卡波姆膠作用24 h黑素細(xì)胞的遷移率略強(qiáng)于12 h(P<0.05),結(jié)果見圖2、表2。

        表2 1%卡波姆膠作用不同時(shí)間對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響 (n=5,±s)

        表2 1%卡波姆膠作用不同時(shí)間對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響 (n=5,±s)

        時(shí)間6 h 1 2 h 2 4 h對(duì)照組3 1.3±2.5 5 0.0±7.5 8 6.0±8.9 1%卡波姆膠組1 2.7±4.5 a 4 3.0±4.0 7 4.3±5.7

        3 討論

        卡波姆 (carbomer)又名聚羧乙烯(carboxy polymethleme,CP),是一種由丙烯酸與烯丙基蔗糖交聯(lián)而成的高分子聚合物,其化學(xué)名為Carboxypolymethylene,卡波姆膠是一種多用途的高分子材料和藥用輔料,在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于藥品和化妝品的研制生產(chǎn),最早由美國(guó)Goodrich公司生產(chǎn),現(xiàn)已收入美、英等國(guó)藥典,我國(guó)2000年版藥典就已收載[2]。卡波姆膠作為黑素細(xì)胞涂布法移植的載體國(guó)內(nèi)外未有報(bào)告。

        我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明:采用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基配置的1%卡波姆膠對(duì)黑素細(xì)胞共培養(yǎng)1 h,3 h,6 h,12 h,24 h及36 h后,分別用臺(tái)盼蘭測(cè)定黑素細(xì)胞存活率及MTT測(cè)定細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,另Transwell培養(yǎng)板測(cè)定發(fā)現(xiàn)1%卡波姆膠在12 h后對(duì)黑素細(xì)胞遷移無影響。以上結(jié)果顯示采用卡波姆膠混合黑素細(xì)胞,不影響體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞生物學(xué)功能,可以作為新型涂布法移植的細(xì)胞載體。

        早在1998年有人將組織工程學(xué)應(yīng)用于白癜風(fēng)細(xì)胞移植。Olsson[3]等將制備好的表皮基底細(xì)胞懸液均勻的移植到色素脫失部位,外用膠原薄膜封包,膠原膜對(duì)黑素細(xì)胞的定植生長(zhǎng)有益處。以后又有人使用組織工程材料比如羧酸、殼聚糖凝結(jié)成膜包被的培養(yǎng)基,可以明顯改善細(xì)胞的生成條件,并減小收獲細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞造成的損傷[4-5]。Van GeelN[6]將透明質(zhì)酸摻入到自體黑素細(xì)胞懸液中,增加細(xì)胞的黏

        度,并還可以促進(jìn)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。近年來,有報(bào)告使用羊膜作為移植載體,可用于黑素細(xì)胞移植。將培養(yǎng)擴(kuò)增后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到該膜上,培養(yǎng)后應(yīng)用到色素脫失部位,取得95%以上的復(fù)色率[7]。本研究不同于以往組織工程的概念,將卡波姆膠引入作為黑素細(xì)胞的載體系統(tǒng),可以起到很好的固定作用,從而解決現(xiàn)有的黑素細(xì)胞移植過程中細(xì)胞懸液易流失的問題,減少黑素細(xì)胞的流失量,提高植入率并且不會(huì)對(duì)黑素細(xì)胞造成損傷,在臨床應(yīng)用中,操作簡(jiǎn)單安全。另外,由于該化合物本身是優(yōu)良、安全的高分子材料和藥用輔料,型號(hào)多樣,可適應(yīng)多種劑型的特點(diǎn),如作為凝膠基質(zhì)、生物黏附材料、緩控釋骨架材料等,在藥學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用[8],加之具有廉價(jià)、容易獲得的特點(diǎn),經(jīng)以上前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí),對(duì)于用于黑素細(xì)胞涂布法移植的臨床實(shí)施具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

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