周永其，胡道德，劉亮，陳文娟

(1.江蘇省太倉(cāng)市第一人民醫(yī)院藥劑科，215400;2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)研究室，200080)

靈杞黃斑顆粒為醫(yī)院制劑(批準(zhǔn)文號(hào):滬藥制字Z05050795)，由當(dāng)歸、肉蓯蓉、菟絲子等中藥材組方而成，具有補(bǔ)腎溫陽(yáng)、益氣健脾、活血生精、通絡(luò)明目之功效，臨床主要用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性疾病。阿魏酸為當(dāng)歸的主要有效成分之一[1-2]，不僅能對(duì)抗氧自由基，使超氧自由基、羥自由基和過氧化氫等生成減少，而且還能與膜磷脂酰醇胺結(jié)合，使膜磷脂不受氧自由基的侵襲，從而發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用[3]。年齡相關(guān)性黃斑變性疾病可能與氧化應(yīng)激有關(guān)[4]。研究顯示，該顆粒劑可能是通過清除自由基抗氧化和抗凋亡而發(fā)揮作用[5]。因此，對(duì)處方中阿魏酸進(jìn)行定量，對(duì)有效控制和提高靈杞黃斑顆粒的質(zhì)量具有重要意義。筆者在本實(shí)驗(yàn)中參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，采用反相高效液相色譜法，對(duì)制劑中阿魏酸進(jìn)行含量測(cè)定，擬建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的含量測(cè)定方法，為靈杞黃斑顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有價(jià)值的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀(四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站)，Mettler Toledo AL-104電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，超聲波清洗器(必能信超聲有限公司)，HP-01真空過濾裝置(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，5415D高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，W2010數(shù)控恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試藥?kù)`杞黃斑顆粒(委托上海練塘中藥廠生產(chǎn)，批號(hào):20100901，20100902，20100903，規(guī)格:每袋15 g)，阿魏酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110773-200611)，甲醇(美國(guó)天地公司，色譜純，批號(hào):807902)。其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)檫M(jìn)樣0～3 min，調(diào)節(jié)流動(dòng)相A∶B(10∶90);3～20 min，流動(dòng)相A∶B(36∶64);20～22 min，流動(dòng)相A∶B(10∶90);流速:1.0 mL·min－1;檢測(cè)波長(zhǎng):316 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算不低于20 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成5.794 mg·mL－1對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液的制備取本品2袋，研成細(xì)粉，精密稱定15 g，置具塞錐形瓶，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液30 mL，置燒瓶，揮去溶劑，精密加入純化水20 mL溶解，置分液漏斗，用乙醚50 mL分3次提取(每次分別加20，20，10 mL)，合并乙醚提取液，置燒瓶中蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，移?0 mL量瓶，并稀釋至刻度，搖勻，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備按處方比例及制法制備缺當(dāng)歸藥材的陰性對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.5 方法專屬性考察在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，分別吸取陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果對(duì)照品、供試品溶液色譜中阿魏酸峰均達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照溶液色譜中無(wú)相應(yīng)吸收峰，表明處方中其他成分對(duì)測(cè)定阿魏酸無(wú)干擾。

2.6 線性關(guān)系考察精密吸取阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇分別制成0.058，0.116，0.232，0.348，0.464，0.579 mg·mL－1溶液，按上述色譜條件各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。以阿魏酸質(zhì)量濃度(ρ，mg·mL－1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:Y=4 443.6ρ－10.135(r=0.999 6，n=6)。表明阿魏酸在0.058～0.579 mg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 檢出限按上述色譜條件測(cè)定，得阿魏酸的檢出限濃度為1.53 μg·mL－1(S/N=3)，定量限濃度為4.67 μg·mL－1(S/N=10)。

2.8 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一阿魏酸對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10 μL。記錄阿魏酸色譜峰面積值，RSD為0.27%(n=5)，表明精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積值，RSD為1.08%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品(批號(hào):20100901)5份，按供試品溶液制備方法平行制備樣品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜峰面積值，代入線性回歸方程得樣品中阿魏酸的平均含量為0.212 mg·g－1，RSD為1.76%(n=5)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法重復(fù)性較好。

2.11 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取9份已知含量的樣品(批號(hào):20100901)各15 g，分別精密加入一定量的阿魏酸對(duì)照品，按供試品溶液制備方法分別制得高、中、低濃度供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜峰面積值。代入線性回歸方程，外標(biāo)法定量，得阿魏酸加樣回收率為97.9%～101.5%，結(jié)果見表1。

2.12 樣品含量測(cè)定取靈杞黃斑顆粒樣品3批(批號(hào):20100901，20100902，20100903)，每批平行測(cè)定3份，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積值，代入線性回歸方程，測(cè)得3批樣品中阿魏酸平均含量分別為0.210，0.216，0.211 mg·g－1。

3 討論

靈杞黃斑顆粒由多味中藥材組成，成分多，相互干擾較大，筆者分別比較了甲醇、甲醇水溶液和水等不同溶劑直接超聲提取樣品，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰較多，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)80%甲醇溶液超聲處理30 min后，用乙醚進(jìn)一步萃取樣品中阿魏酸提取效果最佳。

表1 阿魏酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果mg

在流動(dòng)相的選擇中，由于阿魏酸是弱酸，用弱酸性流動(dòng)相可抑制其電離，使色譜峰峰形穩(wěn)定，分離度好。筆者分別考察了甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等各種比例的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸水溶液(20∶80)洗脫時(shí)，阿魏酸能與其他組分較好分離，但阿魏酸的出峰時(shí)間很長(zhǎng)，且樣品溶液中水溶性雜質(zhì)出峰時(shí)間冗長(zhǎng)。為了縮短阿魏酸的出峰時(shí)間和避免水溶性雜質(zhì)峰的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相梯度洗脫程序?qū)Π⑽核徇M(jìn)行定量，通過選擇在進(jìn)樣前3 min，保持甲醇在流動(dòng)相中的比例為10%，達(dá)到促使水溶性雜質(zhì)較快出峰的目的。

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，采用甲醇-0.1%磷酸水溶液二元梯度洗脫程序?qū)悠分杏行С煞诌M(jìn)行分離、定量，并對(duì)洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了滿意的結(jié)果。同文獻(xiàn)[8-9]比較，縮短了分析周期，提高了分離效果，改善了峰形拖尾，增加了檢測(cè)器靈敏度，同時(shí)還減少了程序進(jìn)樣時(shí)基線波動(dòng)。樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，3批樣品中阿魏酸的含量差異不大。

該測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，精密度和準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定可靠，可用于靈杞黃斑顆粒中阿魏酸的含量測(cè)定，為建立靈杞黃斑顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提供了參考。

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