張俊峰，周武，王濤

(1.湖北省新華醫(yī)院麻醉科，武漢430015;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢430030)

缺血性腦血管病引起的學(xué)習(xí)記憶功能減退，不僅降低患者生活質(zhì)量，威脅人類健康，而且給家庭和社會(huì)造成巨大的負(fù)擔(dān)。丙泊酚(propofol，Pro)是一種抗氧化藥，能拮抗活性氧導(dǎo)致的多種細(xì)胞損傷，具有一定的腦保護(hù)作用[1-2]。但其是否能抑制腦缺血-再灌注所致認(rèn)知功能障礙尚未可知。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)對(duì)缺血低氧性神經(jīng)元具有良好保護(hù)作用，TrkB是NGF的高親和力受體，介導(dǎo)中樞神經(jīng)元NGF依賴性細(xì)胞存活和分化[3-4]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中探討Pro對(duì)腦缺血-再灌注所致認(rèn)知功能障礙的影響，及其對(duì)TrkB/Akt通路的作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料成年雄性SD大鼠，購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量250～280 g。Pro標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)費(fèi)森尤斯公司惠贈(zèng)，批號(hào):J20040122)。DCS-2程控穿梭箱(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所產(chǎn)品)，MG-2Y型迷宮測(cè)試儀(江蘇省張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠產(chǎn)品)。TrkB、p-Akt單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，其余試劑均為分析純。

1.2 腦缺血-再灌注模型的制備與分組將大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只:假手術(shù)組(腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液)，缺血-再灌注組(模型組，腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液)，缺血-再灌注+Pro低、高劑量組(Pro分別為50和100 mg·kg－1，于缺血-再灌注開始前腹腔注射)。大鼠缺血-再灌注模型的制備采用改良的LONGA法[5]，以10%水合氯醛300 mg·kg－1腹腔注射麻醉，頸部正中切口，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，熱凝其分支，頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈置動(dòng)脈夾，斷開頸外動(dòng)脈后插入遠(yuǎn)端涂有硅膠、直徑0.24～0.26 mm的強(qiáng)力漁線，深度為距頸總動(dòng)脈分叉處(18.0±0.5)mm，縫合皮膚。90 min后，拉漁線至頸外動(dòng)脈殘端，血流再通。假手術(shù)組除插線外，其他步驟同模型組。

1.3 避暗實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第1天為訓(xùn)練時(shí)間，將大鼠頭朝外放入避暗箱明室，大鼠會(huì)因趨暗的習(xí)性進(jìn)入暗室，受到電擊1或2次而產(chǎn)生記憶。如大鼠不進(jìn)入，則將其驅(qū)入暗室，使之產(chǎn)生記憶。第2天為測(cè)試時(shí)間，記錄大鼠從放入明室至首次進(jìn)入暗室并遭電擊的時(shí)間，即進(jìn)入暗室前的潛伏期和240 s內(nèi)進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.4 Y型迷宮實(shí)驗(yàn)將受試大鼠放入Y型迷宮內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min，然后給予電刺激，設(shè)定電擊電壓50 V，延遲時(shí)間5 s。隨機(jī)改變電擊區(qū)和安全區(qū)，大鼠遭遇電擊時(shí)直接逃避至安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。每電擊10次后休息5 min。學(xué)習(xí)成績(jī)以達(dá)到連續(xù)10次電擊中有9次正確反應(yīng)(90%正確反應(yīng))前所受的累計(jì)電擊次數(shù)來(lái)表示。24 h后測(cè)定連續(xù)10次電擊中正確反應(yīng)次數(shù)，作為記憶成績(jī)。

1.5 免疫組織化學(xué)再灌注后24 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸經(jīng)左心室行主動(dòng)脈插管，剪開右心房，以37℃0.9%氯化鈉溶液快速?zèng)_洗，再灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛固定液。斷頭取腦后將組織固定于4%多聚甲醛固定液中6 h，再入25%蔗糖磷酸鹽緩沖液4℃過(guò)夜。待組織塊沉底后，恒冷箱冰凍切片機(jī)切片(厚20 μm)，用漂片法制作。生物素復(fù)合物(strejptavidin biotin complex，SABC)法檢測(cè)TrkB、p-Akt的表達(dá)。細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 Western Blot缺血-再灌注24 h后斷頭取腦，快速剝離缺血皮質(zhì)，按照1∶9(W/V)加入裂解緩沖液，4℃勻漿，冰上放置1 h，4℃，12 000 r·min－1離心30 min。上清液進(jìn)行蛋白定量，各組取總蛋白30 μg加入上樣緩沖液煮沸3 min變性，SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。應(yīng)用3%脫脂奶粉室溫封閉30 min，加入1∶1 000稀釋的TrkB、p-Akt 1抗4℃孵育過(guò)夜，與1∶10 000稀釋的2抗室溫孵育1 h，再與化學(xué)發(fā)光試劑溫育1 min后曝光、顯影和定影，測(cè)定吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用SPSS12.0進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 避暗實(shí)驗(yàn)和Y型迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加;Pro各劑量組潛伏期較模型組明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)減少。模型組出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶功能障礙，與假手術(shù)組比較，累計(jì)電擊次數(shù)增加，正確反應(yīng)次數(shù)減少。與模型組比較，Pro各劑量組累計(jì)電擊次數(shù)明顯減少，正確反應(yīng)次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 TrkB表達(dá)及Akt活化免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，假手術(shù)組TrkB及p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少;模型組缺血-再灌注后細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯增多;Pro各劑量組細(xì)胞數(shù)顯著上調(diào)。Western Blot結(jié)果提示:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠皮質(zhì)TrkB及p-Akt表達(dá)無(wú)顯著變化，Pro各劑量組大鼠皮質(zhì)TrkB及p-Akt表達(dá)顯著增高(n=6)，見圖1。

3 討論

Pro化學(xué)成分為2，6-二異丙基苯酚，與內(nèi)源性抗氧化劑生育酚在結(jié)構(gòu)上相似，該結(jié)構(gòu)可與氧自由基反應(yīng)并使之滅活，從而抑制氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，降低自由基的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞趨化因子，減少炎癥細(xì)胞聚集，進(jìn)而減輕炎癥細(xì)胞對(duì)機(jī)體的損傷，具有一定的抗腦缺血-再灌注損傷作用[6]。但其對(duì)缺血-再灌注所致認(rèn)知功能障礙的影響筆者尚未見報(bào)道。

表1 4組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)和Y型迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1Result of step-down test and Y-maze task test of 4 groups animals次，±s

表1 4組大鼠避暗實(shí)驗(yàn)和Y型迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1Result of step-down test and Y-maze task test of 4 groups animals次，±s

與模型組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01;與假手術(shù)組比較，*3P＜0.01Compared with model group，*1P＜0.05，*2P＜0.01;compared with sham operation group，*3P＜0.01

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圖1 4組大鼠皮質(zhì)TrkB表達(dá)(A)及Akt活化(B)情況Fig.1TrkB expression(A)and Akt activation(B)in cortex of 4 groups of rats

腦缺血-再灌注后可導(dǎo)致缺血、低氧及周邊區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡，其機(jī)制與誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)，包括促凋亡基因和抑制凋亡基因有關(guān)。TrkB作為NGF的高親和力受體啟動(dòng)了神經(jīng)元分化及存活的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7-8]，缺血-再灌注損傷4 h后，缺血側(cè)皮質(zhì)就有TrkB表達(dá)升高，并且此升高一直持續(xù)到再灌注后第3天，TrkB的升高對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用[9-10]。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中利用線栓法造成大腦中動(dòng)脈栓塞的局灶性腦缺血-再灌注，制備大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙模型。研究結(jié)果表明，Pro能延長(zhǎng)避暗實(shí)驗(yàn)中潛伏期，減少錯(cuò)誤次數(shù)，減少Y型迷宮實(shí)驗(yàn)中累計(jì)電擊次數(shù)，增加正確反應(yīng)次數(shù)。提示Pro可改善腦缺血-再灌注損傷所致學(xué)習(xí)記憶障礙。本實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組TrkB及p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，模型組細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯增多，而Pro各劑量組細(xì)胞數(shù)顯著上調(diào)。與假手術(shù)組比較，缺血-再灌注后大鼠皮質(zhì)TrkB及p-Akt表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而Pro各劑量組大鼠皮質(zhì)TrkB及p-Akt表達(dá)則顯著增高。

綜上所述，Pro能明顯減輕腦缺血-再灌注所致認(rèn)知功能障礙，可能通過(guò)調(diào)節(jié)缺血-再灌注損傷時(shí)保護(hù)性NGF的高親和力受體TrkB的表達(dá)和Akt活化，激活其下游信號(hào)分子，間接發(fā)揮其抗缺血性腦損傷的作用，但其對(duì)下游信號(hào)分子的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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