許穎智，張軍平，李 明，李良軍，彭 立，張光銀，楊 萃，周亞男

(1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193;2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

四妙勇安湯對實驗性動脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)血管新生的影響*

許穎智1，張軍平2△，李 明2，李良軍2，彭 立1，張光銀1，楊 萃1，周亞男1

(1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193;2．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

目的:探討四妙勇安湯對動脈粥樣硬化(AS)斑塊內(nèi)血管新生的影響及作用機理。方法:隨機將40只日本大耳白兔分為對照組10只，實驗組30只。對照組給予普通飼料，實驗組利用復(fù)合因素制備AS易損斑塊模型，8周時實驗組隨機分為模型組、辛伐他汀組、四妙勇安湯組，第24周取材。主動脈切片進行病理形態(tài)學(xué)觀察，測量內(nèi)膜厚度(IT)、纖維帽厚度(FCT)、纖維帽厚度與內(nèi)中膜厚度比(FCT/IMT)、脂核與斑塊面積比(LCA/PA);免疫組化方法檢測CD31、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、P38 MAPK水平;RT-PCR方法檢測VEGF mRNA表達。結(jié)果:與模型組比較，四妙勇安組 IT降低，F(xiàn)CT、FCT/IMT增加;CD31、VEGF、P38MAPK水平及VEGF mRNA表達顯著下降。結(jié)論:四妙勇安湯可穩(wěn)定AS斑塊，抑制斑塊內(nèi)血管新生，其機制可能與抑制斑塊內(nèi)VEGF和P38MAPK表達有關(guān)。

四妙勇安;AS易損斑塊;血管新生

AS易損斑塊是急性冠脈事件及腦卒中等心腦血管事件的主要原因。在組織學(xué)角度，易損斑塊被定義為偏心性管腔分布、脂質(zhì)含量多(脂質(zhì)池 ＞40%)、炎細胞浸潤明顯、纖維成分少，纖維帽薄(＜65μm)及新生血管多的斑塊［1］。斑塊內(nèi)血管新生成為AS斑塊不穩(wěn)定的重要危險因素，在易損斑塊及斑塊的易損部位更為明顯，與臨床心腦血管事件的發(fā)生有很大關(guān)系。血管新生(angiogenesis)是指在原有的毛細血管基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細胞的增殖與遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生的形式生成新的毛細血管的過程。斑塊內(nèi)血管新生是在AS病變基礎(chǔ)上發(fā)生的，而新生血管又加重了AS病變，在AS斑塊的發(fā)生發(fā)展中斑塊內(nèi)血管新生可能是一個核心事件起著關(guān)鍵性作用。本實驗依據(jù)AS發(fā)病的中醫(yī)學(xué)病機認識，就這一核心問題展開研究。隨著對AS發(fā)病機制的不斷深入認識，人們逐漸認識到熱毒血瘀是AS發(fā)生發(fā)展的的主要病理因素。以往研究表明，具有滋陰活血解毒之功效的四妙勇安湯可抑制 AS的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［2、3］。本實驗從另一角度觀察四妙勇安湯穩(wěn)定AS斑塊的作用機理，探討其對斑塊內(nèi)血管新生的影響機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥物 辛伐他汀:40 mg/片，5片/盒(批號07283)，杭州默沙東制藥有限公司;四妙勇安湯煎劑:金銀花 30g，玄參 30g，當歸 20g，甘草 10g，湯液經(jīng)過旋蒸儀旋蒸濃縮至每毫升含生藥2．25g。四妙勇安湯水煎液制備工藝:前4味藥加水溫浸30min后，分別加10倍、8倍量水煎煮2次，濾過、合并濾液，14000r/min離心 15min取上清液，采用分子截留值5萬的超濾膜進行超濾，超濾過程中控制壓力為 0．1mPa，溫度30℃ ±1℃。四妙勇安湯水煎液質(zhì)控標準:金銀花(綠原酸不得少于1．5%)、玄參(哈巴俄甘不得少于0.05%)、當歸(阿魏酸不得少于 0.05%)、甘草(甘草酸不得少于 2．0%)。

1．2 試劑

VEGF 一 抗 (C-1，SC-7296，SATA CRUZ BIOTECHNOLOGY)、CD31 一抗(JC/70A、ab958、Abcam)。

1．3 儀器

酶標儀(Thermo MK3，上海熱電)、電泳儀(DYY-8C，北京六一儀器廠)、PCR 儀(TC-96，杭州博日科技有限公司)、紫外透射儀(UV-254，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心)、OLYMPUS-BX40生物顯微鏡(奧林巴斯，日本)、HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司)。

1．4 方法

1．4．1 動物分組及給藥 選用普通級雄性日本大耳白兔 40只，體重 2．2kg±0．2kg，由北京市維通利華實驗動物中心提供。隨機分對照組10只，實驗組30只。所有動物均單籠飼養(yǎng)，飲水不限，自由攝食，每日每只給予150g飼料，喂養(yǎng)24周;其正常對照組動物給予普通飼料，其他組動物給予高脂飼料。采用高脂飲食加免疫損傷和球囊拉傷方法建立兔AS斑塊模型［4］，自8周時實驗組隨機分為模型組、辛伐他汀組、四妙勇安組(簡稱為模型組、辛伐組、四妙組)。各給藥組開始給藥至24周取材，給藥量按動物與人用藥量體表面積折算系數(shù)15換算。辛伐他汀5mg/kg/次，1次/d;四妙勇安湯按生藥量11．25g/kg/次，2 次 /d;模型組給予蒸餾水 10ml/次，2次/d。

1．4．2 標本的收集 24周取材，用3%戊巴比妥鈉(30mg·ml－1kg－1)麻醉后將動物固定于手術(shù)臺，取出主動脈血管組織沿縱軸剪開，用生理鹽水輕輕沖洗后一部分置于組織凍存管，液氮保存做PCR備用;一部分置于10%中性福爾馬林固定。

1．4．3 標本的測定 IT、FCT、FCT/IMT、LCA/PA(%)檢測:石蠟包埋，HE、Masson、油紅“O”染色，光鏡觀察病理改變，進行圖像分析并測量 IT、FCT、FCT/IMT、LCA/PA。測量方法:每張片子選取3個低倍視野(10×10)，每個視野測3次取其平均值。

動脈壁斑塊內(nèi) CD31、VEGF、P38MAPK檢測:采用免疫組化方法，檢測分析測量各陽性染色面積占整個場面積的百分比。每張切片隨機觀察5個不同的高倍鏡視野(10×40)，計算陽性細胞(細胞內(nèi)有黃褐色或棕黃色沉淀物)的面積與整個場面積的百分比并取其平均值。

動脈壁VEGF mRNA的表達測試:采用RT-PCR方法檢測，取肉眼有突起地方疑似斑塊部位進行組織勻漿，提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以 β-actin為內(nèi)參做半定量分析。從GenBank中獲得已知的兔VEGF mRNA的序列(序列號AY196796)和兔內(nèi)標基因序列(序列號AF598932)委托上海生工公司合成。反應(yīng)條件:93℃預(yù)變性3 min，93℃ 40 s，72℃ 40s，63℃ 40s，27Cycle，最后 72℃ 延伸 8min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物6μl在1．5%瓊脂糖凝膠上電泳 25 min，拍照留取圖像，以擴增目的片段與β-actin的灰度比值表示所擴增的目的基因片段的相對表達水平。

2 結(jié)果

2．1 四妙勇安湯對腹主動脈病理形態(tài)學(xué)影響

對照組主動脈內(nèi)皮細胞完整，中層平滑肌細胞排列整齊，呈長橢圓形。模型組主動脈見有典型斑塊形成，表面有纖維組織覆蓋，形成典型的較薄“纖維帽”;內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮部分脫落、不完整，內(nèi)皮下見脂質(zhì)、泡沫細胞及炎性細胞浸潤，彈力纖維斷裂溶解，有大量膠原纖維生成。辛伐組內(nèi)膜增厚，有少量泡沫細胞形成，內(nèi)皮完整，中膜平滑肌增殖，彈力板尚完整。四妙組內(nèi)膜增厚，可見若干泡沫細胞，內(nèi)皮完整，中膜平滑肌增殖，排列尚規(guī)則，彈力板尚完整。

2．2 四妙勇安湯腹主動脈內(nèi)中膜的影響

表1顯示，病理檢測結(jié)果顯示，辛伐組和四妙組IT、LCA/PA低于模型組，F(xiàn)CT、FCT/IMT均高于模型組(P ＜0.05，P ＜0．01)。

2．3 四妙勇安湯對腹主動脈組織 CD31、VEGF、P38MAPK水平的影響

表2顯示，模型組 CD31、VEGF、P38MAPK陽性面積百分比高于對照組;各給藥組 CD31、VEGF、P38MAPK陽性面積百分比均低于模型組(P＜0.05 或P＜0.01)。

表1 各組血管壁IT、IT/MT、FCT、FCT/IMT比較

表2 各組主動脈CD31、VEGF陽性面積百分比(%)比較

2．4 四妙勇安湯對腹主動脈VEGF mRNA表達的影響

模型組 VEGF mRNA 表達(1．39±0．38)高于對照組(0．99 ±0．27)，辛伐組和四妙組 VEGF mRNA表達分別為 1．07 ±0．36、0．64 ±0．31 均低于模型組(P ＜0.05，P ＜0．01)。

3 討論

1984年Barger等［5］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜血管生成與AS斑塊之間存在一定關(guān)系，在AS易損斑塊形成和發(fā)展中起到重要作用。AS斑塊內(nèi)新生血管由簡單的內(nèi)皮細胞圍成，周圍沒有支撐的結(jié)締組織，管壁發(fā)育不完善，這些血管脆性大，在周圍細胞因子的作用下容易破裂出血，引起急性冠脈綜合征。

本實驗結(jié)果表明，模型組腹主動脈內(nèi)膜增厚、纖維帽薄、脂核面積增大，斑塊內(nèi) CD68表達增高，大量巨噬細胞浸潤，平滑肌減少;內(nèi)皮細胞標志物CD31陽性面積百分比明顯增高，AS斑塊內(nèi)新生血管增加，模型組主動脈形成易損斑塊［1］。

中醫(yī)學(xué)認為，易損斑塊是熱毒血瘀相互交織、相互影響所致的脈絡(luò)瘀結(jié)。熱毒、痰濁、瘀血三者相互膠結(jié)沉積于虛損之絡(luò)脈，加重了脈管的損傷;日久膠結(jié)不解，凝之愈堅，瘀結(jié)加重，形成 AS易損斑塊。本實驗針對以上病機，運用具有解毒活血功效的四妙勇安湯對AS易損斑塊進行干預(yù)。四妙勇安湯出自《驗方新編》，由金銀花、當歸、玄參、甘草4味藥組成。方中金銀花清熱解毒，玄參滋陰清熱，當歸活血和營，生甘草解毒、調(diào)和諸藥，全方具有清養(yǎng)結(jié)合、毒瘀并驅(qū)，共奏滋陰解毒、活血通絡(luò)之功效。本實驗結(jié)果表明，四妙勇安湯可降低內(nèi)膜厚度、增加纖維帽厚度，使巨噬細胞、脂質(zhì)含量減少，膠原及平滑肌增多，還可降低斑塊內(nèi)CD31的表達，抑制斑塊內(nèi)血管新生，從而穩(wěn)定AS易損斑塊。為闡明其作用機制，本實驗對P38MAPK、VEGF及 VEGF mRNA表達進行了觀察。

結(jié)果提示，模型組斑塊內(nèi) P38 MAPK和 VEGF活性增高。P38 MAPK是一種重要的蛋白酶，是成纖維細胞分泌VEGF所必需的［5］。MAPK作為轉(zhuǎn)錄因子可轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，啟動特定基因的表達，完成VEGF相應(yīng)的促增殖作用［6］。VEGF是一種具有促進新生血管形成和組織修復(fù)作用的血管生成因子［7］，能促進內(nèi)皮細胞分裂、增殖、遷移、趨化，發(fā)揮抗細胞凋亡的作用［8］;動員骨髓中的內(nèi)皮祖細胞進入外周循環(huán)，定位到缺血組織，在原位分化形成成熟的內(nèi)皮細胞，形成新的血管［9］。本研究結(jié)果提示，四妙勇安湯具有抑制AS斑塊內(nèi)P38 MAPK活性的作用，并具有和辛伐他汀同樣的效果［10］，抑制斑塊內(nèi)VEGF蛋白和基因表達。這可能是四妙勇安湯抑制斑塊內(nèi)血管新生的機制之一。

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Effects of Simiao Yongan Tang on angiogenesis in plaque of experimental artherosclerosis

XU Ying-zhi1，ZHANG Jun-ping2△，LI Ming2，LI Liang-jun2，PENG Li1，ZHANG Guang-yin1，YANG Cui1，ZHOU Ya-nan1
(1．Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193，China;2．The First Hospital affiliated to Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin300193，China)

Objective:To observe the effect of Simiaoyongan Decoction(SYD)on angiogenesis in rabbit’s Atherosclerosis(AS)plaque．Methods:40 Japanese white rabbits were randomly divided in two groups，that is，the control group(n=10，normal diet)and the experiment group(n=30)，in which AS vulnerable plaque model was established by feeding high-fat diet，injecting Bovine Serum Albumin(BSA)and balloon catheter overstretching on abdominal aorta artery．At the 8th week，30 animals in experiment group were randomly divided in three groups，that is，model group(n=10)，SYD group(n=10)，simvastatin group(n=10)．The rabbits were sacrificed at the 24th week．Pathological changes were observed by HE，oil red O and Masson staining，and then measured intimae thickness(IT)，fiber cat thickness(FCT)，F(xiàn)CT/IMT，lipid core area to plaque area ratio(LCA/PA)．CD31，VEGF，P38 MAPK protein were detected with immunohistochemistry(IHC)，and VEGF mRNA signal was assessed by polymerase chain reaction(PCR)．Results:IT in SYD group was lower and FCT，F(xiàn)CT/IMT levels were higher than that of the model group．Compared with the model group，the levels of CD31，VEGF，P38MAPK in the SYD group decreased，and VEGF mRNA expression was inhibited by SYD(P＜0．01or P ＜0.05)．Conclusion:SYD could suppress angiogenesis in AS plaque to stabilize AS vulnerable plaque．It may act by decreasing P38 MAPK，VEGF protein and VEGF mRNA expressions．

Si miao yong’an Decoction;angiogenesis;atherosclerosis plaque

R285．5

B

1006-3250(2012)02-0161-03

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目資助(206009);國家自然科學(xué)基金項目 (30901890);天津市自然科學(xué)基金重點資助項目(09JCZDJC20700)

許穎智(1979-)，女，山東人，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)心腦血管疾病臨床與研究。

△通訊作者:張軍平(1965-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管疾病的臨床與研究，E-mail:tjzhtcm@163．com。

2011-08-09