孫闊，粟暉，姚志湘，黃培賢，蘇傳婷

(廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州 545006)

阿司匹林作為一種光譜的解熱鎮(zhèn)痛的非甾體抗炎藥是由水楊酸乙?；磻?yīng)制得，傳統(tǒng)的分析方法為滴定法和高效液相色譜法等。2005版《中國藥典》[1]以中性乙醇為溶劑、酚酞為指示劑，用NaOH滴定其含量，步驟繁瑣，誤差較大；高效液相法[2–3]測量結(jié)果精確度高，但分析時間較長。

拉曼光譜分析具有無損性、監(jiān)測靈敏度高、檢測時間短等優(yōu)點，使用光纖探頭無需取樣就能夠快速采集阿司匹林合成體系的拉曼信息,可對多組分進(jìn)行同時測定[4]。由于待測組分在拉曼光譜數(shù)據(jù)中有多個特征峰位[5]，各個待測組分與它們的特征峰位的光譜數(shù)據(jù)之間存在交迭現(xiàn)象，很難分離出某個特征峰以便對其組分濃度進(jìn)行定量分析，因此拉曼光譜分析需要用到多元校正技術(shù)[6–7]以克服多重相關(guān)性造成的信息重疊，解釋體系內(nèi)的綜合變量，區(qū)分反應(yīng)組分信息與背景噪聲。已知組分的回歸預(yù)測即對白色體系的回歸預(yù)測[8]，主成分回歸和偏最小二乘法都可以提取組分變量的特征信息[9]，而后者進(jìn)行光譜矩陣分解時考慮了待測屬性矩陣的信息，使得顯著包含待測屬性特征的光譜區(qū)有更大的權(quán)重。Thomas等人[10]對經(jīng)典最小二乘 (PLS)、主成分回歸和偏最小二乘在定量校正中應(yīng)用進(jìn)行了比較，認(rèn)為偏最小二乘是對組分預(yù)測最優(yōu)的方法。

由于拉曼光譜易受監(jiān)測環(huán)境的影響，在采集拉曼光譜過程中光程變化以及光程中介質(zhì)變化都會引起光的吸收變化造成基線漂移[11]。因此為了提高分析準(zhǔn)確度，經(jīng)常在回歸之前要對光譜進(jìn)行預(yù)處理，降低背景干擾，除去部分噪聲提高信噪比。通常的預(yù)處理方案[12–14]有均值中心化標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換及去趨勢、平滑及求導(dǎo)等。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

水楊酸、乙酰水楊酸、乙酸酐、乙酸：分析純；

激光發(fā)射器：Laser-785型，美國Danger公司；

拉曼光譜儀：科研級，QE65000型，美國Ocean optics公司；

光纖探頭：BAC100–785–OEM 型，美國 Ocean optics公司；

電子分析天平：ALC–210.4型，德國Acculab公司；

1.2 溶液制備和拉曼信息的采集

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

阿司匹林合成路線見圖1。

圖1所示阿司匹林的合成體系中主要為5個組分，分別為阿司匹林、水楊酸、乙酸、乙酸酐、催化劑(濃硫酸或氨基磺酸)。其中變量為4個：阿司匹林、水楊酸、乙酸、乙酸酐，假設(shè)反應(yīng)結(jié)束水楊酸反應(yīng)完全，則反應(yīng)前后的水楊酸–乙酸酐–阿司匹林的當(dāng)量比分別為n∶2n∶0和 0∶n∶n，配制41個樣本溶液。水楊酸、乙酸酐、阿司匹林3組分物質(zhì)的量的范圍分別為 5～0 mmol；10～5 mmol；0～5 mmol，隔0.125 mmol遞減和遞增,用乙酸定容至10 mL。

1.2.2 拉曼信息的采集

以波長785 nm激光作光源，通過BAC100–785–OEM光纖探頭收集拉曼信息，對ocean optics spectrasuite工作站菜單選擇x軸單位設(shè)置為拉曼位移，積分時間選擇是1／s，獲取拉曼光譜波長范圍為0～2000 cm–1。將41個標(biāo)準(zhǔn)溶液分別倒入光程為1 cm石英比色皿中采集實驗樣本的光譜數(shù)據(jù)并保存。

2 數(shù)據(jù)處理與討論

2.1 訓(xùn)練樣本集制備

在41個樣本中從第3個樣本到第39個樣本每隔4個樣本選取10個樣本作為檢驗集，剩余作為校正集。從圖2中可看出，41個樣本的拉曼光譜交迭并且存在基線漂移，拉曼光譜漂移較為明顯的一條為預(yù)測集第5個樣本。

2.2 PLS 回歸

選取全波長范圍的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS回歸。主成分即引起光譜變化的樣本主要變量為阿司匹林、水楊酸、乙酸、乙酸酐。變量數(shù)目為4，交叉驗證方法“逐一法”對檢驗集回歸，原始數(shù)據(jù)PLS檢驗集結(jié)果及評價如圖3所示。

由圖 3(a)，(b)，(c)中檢驗集的水楊酸、乙酸酐、阿司匹林原始數(shù)據(jù)PLS回歸結(jié)果的真實值與預(yù)測值相關(guān)圖可以看出，多數(shù)樣本點的殘差杠桿都在回歸線附近均勻分布，第5個樣本點出現(xiàn)高杠桿。圖3(d)中多數(shù)樣本分布在Q和T2的可信區(qū)間內(nèi)，第5個樣本為異常值[QResidual=1.25×107>(95.0%limit=4.34×105)，HotellingT2=678>(95.0% limit=12.1)，差異顯著]，其差異可認(rèn)為是由系統(tǒng)誤差造成的。由圖2訓(xùn)練樣本拉曼光譜可看出，此樣本拉曼光譜明顯漂移造成回歸殘差較大。

3.3 原始數(shù)據(jù)PLS回歸模型及經(jīng)預(yù)處理的PLS回歸模型評價

3.3.1 拉曼光譜預(yù)處理方案選擇

為了減小因光程變動而造成的基線漂移的影響，增強(qiáng)樣本光譜以及濃度的差異性，經(jīng)試驗選定回歸結(jié)果較好的5種光譜預(yù)處理方案，表1中A到F為原始光譜和所選定的5種光譜預(yù)處理方案。

表1 拉曼光譜預(yù)處理方案

3.3.2 校正集PLS評價

原始光譜與所選五種光譜預(yù)處理方案校正集中回歸結(jié)果比較，校正集稱量值與擬合值相關(guān)系數(shù)R2、校正均方根誤差RMSEC、交互驗證均方根誤差RMSECV如表2所示。

表2 校正集PLS回歸結(jié)果評價

表2中方案B用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后，校正集的相關(guān)系數(shù)，校正均方根誤差和交互驗證均方根誤差與方案A原始數(shù)據(jù)有明顯改善，方案C在方案B的基礎(chǔ)上中間增加了Savitzky-Go1ay五點二次平滑處理，校正均方根誤差有所增加，但交互驗證均方根誤差減小。方案D，E，F(xiàn)經(jīng)Savitzky-Go1ay點二次平滑一階卷積求導(dǎo)校正集中線性系數(shù)和校正均方根誤差與方案A原始數(shù)據(jù)比較并沒有變化，交互驗證均方根誤差略有降低。

3.3.3 檢驗集PLS評價與方案確定

原始光譜與所選5種光譜預(yù)處理方案預(yù)測集中回歸結(jié)果比較，檢驗集稱量值與擬合值相關(guān)系數(shù)R2、預(yù)測均方根誤差RMSEP如表3所示。

表3 檢驗集PLS回歸結(jié)果評價

表3中方案B～F檢驗集中相關(guān)系數(shù)和預(yù)測均方根誤差與方案A原始數(shù)據(jù)比較都有很好的改善；方案B標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后，檢驗集的線性系數(shù)，預(yù)測均方根誤差有明顯改善；方案C在方案B的基礎(chǔ)上增加了Savitzky-Go1ay五點二次平滑處理，檢驗集的線性系數(shù)，預(yù)測均方根誤差較方案C有所改善；方案D，E，F(xiàn)經(jīng)Savitzky-Go1ay五點二次平滑一階卷積求導(dǎo)預(yù)測集中線性系數(shù)和預(yù)測均方根誤差較為滿意，方案D中雖然阿司匹林的相關(guān)系數(shù)較方案E和方案F低，但乙酸酐的線性系數(shù)有所提高，并將預(yù)測均方根誤差降至最低分別為0.00815，0.010265，0.011101。

由上述結(jié)果對此模型選定預(yù)處理方案為D矢量歸一+Savitzky-Go1ay五點二次平滑一階卷積求導(dǎo)+均值中心化，主成分選4，采用“逐一法”對模型進(jìn)行回歸結(jié)果如圖4所示。

經(jīng)矢量歸一+Savitzky-Go1ay五點二次平滑一階卷積求導(dǎo)+均值中心化對拉曼光譜預(yù)處理再進(jìn)行PLS回歸，由圖4(a)，(b)，(c)中檢驗集的水楊酸、乙酸酐、阿司匹林真實值與預(yù)測值相關(guān)圖可以看出，幾乎所有樣本點的殘差杠桿都在回歸線附近均勻分布，沒有出現(xiàn)明顯的高杠桿。(d)中多數(shù)樣本分布在Q和T2的可信區(qū)間內(nèi)，第5個樣本的QResidual(0.000124)大于 95.0% limit(8.32×10–6)存在異常，HotellingT2=10.3<(95.0% limit=12.1)，此差異是偶然誤差引起的正常差異，故此預(yù)處理方案可以采用。

綜上所述，雖然QResidual=0.000124超過了Q的可信區(qū)間 (95.0% limit=8.32×10–6)，HotellingT2=10.3在T2的可信區(qū)間(95.0% limit=12.1)被認(rèn)為是偶然誤差不可避免，再綜合檢驗集R2和RMSEP，回歸結(jié)果較為滿意。

4 結(jié)論

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換Savitzky-Go1ay五點二次平滑再標(biāo)準(zhǔn)化后雖然對校正集自身擬合的程度很好，對檢驗集卻不如經(jīng)過Savitzky-Go1ay五點二次平滑一階導(dǎo)數(shù)的擬合效果好。經(jīng)過Savitzky-Go1ay五點二次平滑一階導(dǎo)數(shù)的擬合結(jié)果交互驗證均方根誤差有所改善，并且對外部檢驗集有理想的擬合效果。較大程度減小了由光譜監(jiān)測環(huán)境的影響和光程變化以及光程中介質(zhì)變化引起基線漂移。

對于此分析模型，采用矢量歸一+Savitzky-Go1ay五點二次平滑一階卷積求導(dǎo)+均值中心化對拉曼光譜預(yù)處理，PLS主成分選4，交互驗證選用“逐一法”可對阿司匹林反應(yīng)體系3組分進(jìn)行同時測定，可應(yīng)用于阿司匹林合成體系在線濃度的測量，為后續(xù)質(zhì)量預(yù)測、動態(tài)優(yōu)化控制工作提供了有力的數(shù)據(jù)支持。

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