黃慧雅，蘇震，薛向陽，謝媚媚，余業(yè)成

（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000，1.附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科；2.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；3.仁濟學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系）

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展到終末期腎衰的公共通路。腎臟纖維化牽涉到細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的過度沉積和上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程。

microRNA（簡稱miRNA）是近年來新發(fā)現(xiàn)的長22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，主要作用是抑制基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上保證基因表達(dá)的準(zhǔn)確性。研究表明miRNAs能抑制三分之一以上的人類基因[1]。miRNAs在心臟[2-3]、肺[4]、肝臟[5]、皮膚[6-7]中作為組織纖維化的調(diào)節(jié)因子，在腎臟纖維化中，miRNAs通過轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路來調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[8-9]。目前已有研究報道在肝臟、心臟、肺、皮膚纖維化過程中，miR-29c表達(dá)均下調(diào)[2，5-6，10-11]。我們的前期研究通過建立單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠模型及5/6大鼠腎大部切除模型，發(fā)現(xiàn)隨腎組織纖維化的進(jìn)展，miR-29c表達(dá)逐漸下調(diào)。

本研究中我們采用TGF-β1誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，觀察miR-29c及膠原I（Col I）表達(dá)變化，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式使miR-29c過表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染的miR-29c對ECM的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株（NRK-49F，美國模式培養(yǎng)物集存庫），含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基（GIBICO公司，美國），轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 Reagent（Invitrogen公司，美國），TGF-β1（R&D公司，美國），小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體（Abcam公司，美國），兔抗大鼠Col I單克隆抗體（Merk公司，德國），小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），山羊抗小鼠IgG（Abcam公司，美國），山羊抗兔IgG（Santa Cruz公司，美國），Trizol reagent（Invitrogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化：大鼠NRK-49F細(xì)胞用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以1:3傳代。待細(xì)胞80%融合時，0.1% BSA培養(yǎng)16 h后，用TGF-β1刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)分化：①用不同濃度（0.1、1、2、5、10 ng/mL）TGF-β1對NRK-49F進(jìn)行刺激，并且設(shè)空白對照組，各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h；②用TGF-β12 ng/mL對NRK-49F進(jìn)行刺激，分別在培養(yǎng)0、6、12、24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 化學(xué)合成的miR-29c mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞：miRNA mimics是化學(xué)合成的miRNA，通過LipofectminTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d細(xì)胞傳代鋪板，待細(xì)胞生長至60%～80%，將LipofectminTM2000加入培養(yǎng)液中靜置5 min，再與miR-29c mimics/inhibitor（1:1）混勻后靜置15 min，將混合液加入細(xì)胞中8 h，換用0.1% BSA的DMEM/F12培養(yǎng)液饑餓8 h后收取細(xì)胞。分組如下：空白對照組、轉(zhuǎn)染miR-29c mimics 25 nmol/L組、mimics 50 nmol/L組、mimics 75 nmol/L組、miR-29c mimics陰性對照組、miR-29c inhibitor組、miR-29c inhibitor陰性對照組。

1.2.3 轉(zhuǎn)染miR-29c mimics后TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞株：按1.2.2轉(zhuǎn)染步驟將miR-29c mimics轉(zhuǎn)染入NRK-49F細(xì)胞中，8 h后換用0.1% BSA的DMEM/F12培養(yǎng)液再饑餓8 h，加入2 ng/mL TGF-β1刺激24 h后收集各組細(xì)胞。分：空白對照組、TGF-β1組、miR-29c mimics組、miR-29c mimics+TGF-β1組、miR-29c mimics陰性對照組、miR-29c mimics陰性對照+TGF-β1組、miR-29c inhibitor組、miR-29c inhibitor+TGF-β1組、miR-29c inhibitor陰性對照+TGF-β1組。miR-29c mimics及inhibitor濃度均為50 nmol/L。

1.2.4 Realtime PCR法檢測各組細(xì)胞miRNA、Col I和膠原III（ColIII）、纖連蛋白（FN）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA的表達(dá)：采用Trizole一步法抽提總RNA。取1μL RNA溶液，紫外分光光度計分別測波長260 nm和280 nm的光密度（OD）值，并計算RNA的濃度。

cDNA反應(yīng)條件：70 ℃ 10 min 預(yù)變性，42 ℃60 min，70 ℃ 15 min，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物用DEPC水稀釋2.5倍，于－20 ℃保存。以cDNA為模板，進(jìn)行Realtime PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃30 s，40個循環(huán)。至少重復(fù)6次。

Realtime PCR數(shù)據(jù)分析采用定量PCR中的相對定量法，記錄各樣本熒光動力曲線圖和溶解曲線圖，記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，目的基因的相對量＝2－△△Ct，在該公式中，△△Ct=[Ct目的基因（待測樣品）－Ct內(nèi)參（待測樣品）]－Ct目的基因（校正樣品）－Ct內(nèi)參（校正樣品）]。

1.2.5 Western blot法檢測細(xì)胞α-SMA、Col I的表達(dá)：收獲細(xì)胞，裂解后抽提總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量50μg，轉(zhuǎn)膜后加入單抗[α-SMA單克隆抗體（1:250）、Col I單克隆抗體（1:1000）、β-actin單克隆抗體（1:1000）]4 ℃孵育過夜，洗滌，加入HRP標(biāo)記的二抗[辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG（1:2000）]孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法曝光。各組實驗至少重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)之間采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對NRK-49F細(xì)胞中Col I、Col III、α-SMA、FN mRNA和α-SMA蛋白的影響 不同濃度（0.1、1、2、5、10 ng/mL）TGF-β1刺激NRK-49F 24 h后，Realtime PCR分析Col I、ColIII、α-SMA、FN mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，2、5、10 ng/mL TGF-β1濃度組其ColI、ColIII、α-SMA mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，并呈濃度依賴性（P＜0.05）。10 ng/mL TGF-β1濃度組FN表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見表1。Western blot法檢測結(jié)果提示隨著TGF-β1刺激NRK-49F的濃度增加，α-SMA蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，呈濃度依賴性增高（見圖1A）。TGF-β1在2 ng/mL濃度下，Col I及α-SMA蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05，見圖2A-B）。2 ng/mL濃度TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞0、6、12、24 h，ColI、ColIII、α-SMA、FN mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，見表2）；且α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，呈時間依賴性（見圖1B）。在TGF-β1刺激24 h時，ColI、ColIII、FN及α-SMA蛋白上調(diào)最為顯著。

表1 Realtime PCR檢測不同濃度TGF-β1刺激細(xì)胞24 h后ColI、ColIII、FN、α-SMA mRNA及miR-29c表達(dá)變化（n=4±s）

表1 Realtime PCR檢測不同濃度TGF-β1刺激細(xì)胞24 h后ColI、ColIII、FN、α-SMA mRNA及miR-29c表達(dá)變化（n=4±s）

與0 ng/mL組比：aP<0.05，bP<0.01

TGF-β1濃度（ng/mL）10 1.43±0.40b 3.08±0.94b 2.55±0.81a 1.51±0.32a 0.14±0.20b 0 0.1 1.13±0.17 1.61±0.67 1.04±0.06 0.98±0.12 1.05±0.25 1 2 5 ColI ColIII α-SMA FN miR-29c 1±0 1±0 1±0 1±0 1±0 1.21±0.24a 2.15±0.41 1.35±0.26a 1.21±0.18 0.59±0.30 1.58±0.75a 2.04±0.59b 1.8±0.51a 1.7±0.56 0.53±0.24b 1.53±0.39b 2.39±0.61b 1.82±0.27b 1.64±0.71 0.32±0.12b

表2 Realtime PCR檢測2 ng/mL TGF-β1刺激細(xì)胞不同時間后ColI、ColIII、FN、α-SMA mRNA及miR-29c表達(dá)變化（n=4±s）

表2 Realtime PCR檢測2 ng/mL TGF-β1刺激細(xì)胞不同時間后ColI、ColIII、FN、α-SMA mRNA及miR-29c表達(dá)變化（n=4±s）

與0 h組比：aP<0.05，bP<0.01

TGF-β1刺激時間（h）0 6 ColI ColIII α-SMA FN miR-29c 1±0 1±0 1±0 1±0 1±0 2.98±0.32 2.76±1.03 3.77±0.66 2.05±0.64 0.55±0.20b 12 4.01±0.05 2.97±1.18b 3.97±1.00b 4.02±1.50b 0.4±0.20b 24 4.14±1.5b 11.37±2.79a 4.78±0.75b 7.00±2.41b 0.51±0.24b

圖1 TGF-β1刺激NRK-49F后α-SMA表達(dá)變化

結(jié)果顯示，2 ng/mL TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞24 h后，促進(jìn)NRK-49F轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)ECM合成及α-SMA表達(dá)上調(diào)。

2.2 TGF-β1對NRK-49F細(xì)胞中miR-29c的影響 不同濃度 TGF-β1（0、0.1、1、2、5、10 ng/mL）刺激NRK-49F細(xì)胞24 h，Realtime PCR分析結(jié)果顯示，隨著TGF-β1濃度增加，細(xì)胞內(nèi)miR-29c表達(dá)逐漸下降。TGF-β1濃度為2 ng/mL開始，同對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2 ng/mL TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞0、6、12、24 h后，Realtime PCR分析結(jié)果顯示，隨著TGF-β1作用時間的延長，細(xì)胞內(nèi)miR-29c表達(dá)下調(diào)，在TGF-β1作用6 h開始，同對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 過表達(dá)miR-29c后ColI表達(dá)下降 運用化學(xué)合成的miR-29c mimics（使miR-29c過表達(dá)），用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染入NRK-49F細(xì)胞株。Realtime PCR分析顯示，在轉(zhuǎn)染入miR-29c mimics 8 h后，與空白對照組相比，NRK-49F細(xì)胞株中miR-29c的表達(dá)水平至少增加了243倍。在NRK-49F細(xì)胞株中過表達(dá)miR-29c導(dǎo)致了ColI、ColIII mRNA表達(dá)下調(diào)，與miR-29c mimics呈明顯的濃度依賴性（P＜0.05，見表3）。50 nmol/L miR-29c mimics轉(zhuǎn)染NRK-49F細(xì)胞株后，ColI蛋白表達(dá)較空白對照組下調(diào)，提示了在miR-29c mimics作用下，ColI轉(zhuǎn)錄減少（見圖2A）。但是抑制miR-29c（miR-29c inhibitor 50 nmol/L）后，NRK-49F細(xì)胞株中，ColI的mRNA表達(dá)無明顯變化（P＞0.05，見表3），而其蛋白表達(dá)升高（見圖2B）。

2.4 在NRK-49F中miR-29c與TGF-β1聯(lián)合作用對ColI、α-SMA表達(dá)的作用 TGF-β1能刺激NRK-49F細(xì)胞株表達(dá)ColI、α-SMA（P＜0.05，見表1-2、圖2）。而在轉(zhuǎn)染miR-29c mimics 50 nmol/L后，用2 ng/mL TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞株24 h，發(fā)現(xiàn)ColI及α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)（與對照組相比）不升高（P＞0.05，見表4、圖2A）。

表3 轉(zhuǎn)染不同濃度miR-29c mimics/inhibitor對ColI及ColIII mRNA的影響（n=4±s）

表3 轉(zhuǎn)染不同濃度miR-29c mimics/inhibitor對ColI及ColIII mRNA的影響（n=4±s）

（A：空白對照組；B：25nmol/L mimics組；C：50nmol/L mimics組；D：75nmol/L mimics組；E：mimics陰性對照組；F：50 nmol/L inhibitor組；G：inhibitor陰性對照組）與A組比：aP<0.05，bP<0.01

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表4 轉(zhuǎn)染不同濃度miR-29c mimics/inhibitor后加入2 ng/mL TGF-β1刺激24 h對ColI及ColIII mRNA的影響（n=4±s）

表4 轉(zhuǎn)染不同濃度miR-29c mimics/inhibitor后加入2 ng/mL TGF-β1刺激24 h對ColI及ColIII mRNA的影響（n=4±s）

(A：空白對照組；B：25nmol/L mimics+TGF-β1組；C：50nmol/L mimics+TGF-β1組；D：75nmol/L mimics+TGF-β1組；E：mimics陰性對照+TGF-β1組；F：50nmol/L inhibitor+TGF-β1組；G：inhibitor陰性對照+TGF-β1組)與A組比：aP<0.05，bP<0.01

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圖2 轉(zhuǎn)染 miR-29c mimics/inhibitor對TGF-β1促轉(zhuǎn)分化的作用

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是以腎小管基底膜的增厚和間質(zhì)成分如I型、III型、IV膠原和FN的增多、基質(zhì)的堆積為特征。表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞不僅是ECM的主要來源，也是腎臟疾病進(jìn)展過程中的重要標(biāo)志[12]。TGF-β1促進(jìn)腎臟膠原蛋白的產(chǎn)生和沉積，促使腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，是腎臟纖維化啟動及進(jìn)展的主要細(xì)胞因子。肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致腎臟纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞，它具有很強的合成ECM能力，在腎臟纖維化中起主要作用。TGF-β1促使NRK-49F細(xì)胞株中ColI、ColIII、FN及α-SMA表達(dá)升高，并具有促進(jìn)NRK-49F細(xì)胞株增殖的作用，具有劑量依賴及時間依賴效應(yīng)[13-14]。

miR-29家族成員包括miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2和miR-29c[15]。在大鼠心、肝、脾、肺、腦、腎組織中均發(fā)現(xiàn)miR-29家族成員（miR-29a/b/c）表達(dá)，尤其在大腦、肺、心及腎臟中miR-29c表達(dá)很高[2]。miR-29涉及到肺間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)分化、骨骼肌細(xì)胞分化，抑制心肌纖維化及系統(tǒng)性硬化[2，6，15-18]。在鼻咽癌及心肌梗死導(dǎo)致的心臟纖維化中，miR-29的下調(diào)同膠原增加呈負(fù)相關(guān)[2，16]。miR-29家族能夠抑制ECM的產(chǎn)生[10，16，19-22]。miR-29家族可在肝臟星形細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)，且均在TGF-β1的刺激下表達(dá)下降[22-23]。但是，目前尚鮮有關(guān)于miR-29家族（miR-29a/b/c）在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞內(nèi)作用的研究報道。

本課題組前期用莖環(huán)Realtime PCR檢測5/6大鼠腎大部切除模型及UUO模型的腎組織中的miRNAs表達(dá)變化，用高通量測序技術(shù)（Solexa測序）檢測在術(shù)后1 d和術(shù)后3 d處死的UUO大鼠手術(shù)側(cè)與非手術(shù)側(cè)腎臟組織中miRNAs的表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)隨著腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，miR-29c表達(dá)明顯下降，而miR-29a/b在腎間質(zhì)纖維化中變化不顯著，因此，我們在本研究中選用miR-29c作為研究對象。

查閱腎臟纖維化過程中與ECM產(chǎn)生積聚相關(guān)的一系列基因，它們均包含有多個miR-29c的種子序列相對應(yīng)的堿基（見圖3），說明miR-29c的下調(diào)同腎臟纖維化相關(guān)。本研究提示在TGF-β1誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞纖維化過程中miR-29c表達(dá)下調(diào)，miR-29c mimics通過有效抑制TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞株ColI表達(dá)起到抗纖維化作用，表明miR-29c為抑制纖維化的基因；人工合成的miR-29c mimics轉(zhuǎn)染NRK-49F細(xì)胞株能有效提高miR-29c表達(dá)量從而抑制ColI表達(dá)。

圖3 miR-29與其靶基因相對應(yīng)的種子序列

van Rooij等[2]人在心肌纖維化模型中發(fā)現(xiàn)miR-29家族表達(dá)下調(diào)，構(gòu)建熒光素酶報告基因載體證實編碼ColI、ColIII及FN等多種ECM成分的mRNAs是miR-29家族的靶基因。Ogaw等將miR-29b的前體轉(zhuǎn)染到未激活的肝星狀細(xì)胞中，能夠顯著抑制ColI的表達(dá)[23]?？梢?，ColI為miR-29c的靶基因，miR-29c能抑制其表達(dá)。在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生時或發(fā)生前，維持細(xì)胞的miR-29表達(dá)可抑制或延緩纖維化進(jìn)展。因此，化學(xué)合成的miRNA mimics通過維持miR-29c的表達(dá)從而延緩或抑制纖維化過程；miR-29c對靶基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯均有抑制作用，化學(xué)合成的單鏈RNA分子miR-29c inhibitor轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后結(jié)合到成熟的miRNA上，特異性抑制miR-29c功能，使膠原蛋白翻譯增加，而不影響其轉(zhuǎn)錄。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-29c能作用于腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，使得ColI表達(dá)下調(diào)。顯示了miR-29c在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中有抗纖維化作用：miR-29c mimics通過有效抑制TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞株ColI表達(dá)起到抗纖維化作用，為治療腎間質(zhì)纖維化提供了一個新的靶點。

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