李妙齡，唐漢慶，王 勇，郭 健，龐宇舟，李國彰△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001)

苦參堿(Matrine)是從豆科植物苦參(sophora flaescens Ait)、苦豆子(S.alopecuroides L)及廣豆根(S.subrostrata)中分離出來的生物堿，是白金雀八堿的異構(gòu)體，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，分子式為C15H24N20，是苦參的主要成分。已有研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿有抗心律失常作用［1］，能拮抗烏頭堿、氯化鋇、哇巴因、腎上腺素以及結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支誘發(fā)的心律失常，且其抗心律失常作用隨劑量的增加而加強(qiáng)，其對(duì)烏頭堿所致的心律失常作用尤佳，但確切的抗心律失常機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)微電極技術(shù)和細(xì)胞膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，觀察在烏頭堿誘發(fā)心律失常的條件下，苦參堿對(duì)豚鼠心室肌動(dòng)作電位及細(xì)胞膜鈉通道(INa)的作用，研究其抗心律失常的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

豚鼠，雌雄不限，體重300g～400g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥品與試劑

苦參堿購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)，純度大于99%，用水溶解;Collagenase II購于 Worthington公司;HEPE購于sigma試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位的記錄［2］

將豚鼠擊頭致昏后，迅速分離心臟置于100%O2飽和的臺(tái)式液中(mmol·L－1:NaCl 147，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.05，HEPES 10，Glucose 11，NaOH調(diào)節(jié) pH至7.4)，快速分離心室乳頭肌后固定于恒溫浴槽中，以持續(xù) 100%O2、溫度為 36℃ ±0.5℃的臺(tái)氏液灌流，流速3ml·min－1，平衡2h后用于實(shí)驗(yàn)。用鉑金電極置于肌條的兩側(cè)作為刺激電極，用有芯玻璃毛細(xì)管(Havard，USA)在拉制儀(P-97，Sutter，USA)上進(jìn)行拉制，將充灌 3mol·L－1KCl的玻璃微電極(阻抗 20～30 MΩ)插入 Ag-AgCl引導(dǎo)電極，固定于三維微操縱器(Narishige，Japan)上，用參比電極接地。電極入水后調(diào)零，緩慢插入電極至出現(xiàn)靜息電位(RP)時(shí)，由電子刺激器(SEN 7203，Nihon Kohden，Japan)發(fā)放刺激脈沖(2ms，1.5倍閾電壓)，通過隔離器(SS-202J，Nihon Kohden，Japan)將形成的場(chǎng)刺激作用于豚鼠乳頭肌，誘發(fā)乳頭肌的動(dòng)作電位。引導(dǎo)的生物信號(hào)通過微電極放大器(MEZ 7200，Nihon Kohden，Japan)放大后應(yīng)用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420 E+，泰盟，成都)在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行實(shí)時(shí)采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3.2 豚鼠心室乳頭肌的細(xì)胞分離方法 開胸迅速取出心臟，置于氧飽和的4℃無鈣臺(tái)式液中(mmol·L－1:NaCl 135;KCl 5.4;MgCl21;NaH2PO40.33;Glucose 10;HEPES 5;NaOH調(diào)pH至7.4)，輕輕擠壓心臟、排出殘血。迅速將心臟移至Langendorff裝置上(恒溫37℃)，先用氧飽和的無鈣臺(tái)式液灌流 5min，流速 10ml.min－1，然后用酶液(CaCl234μM，CollagenaseⅡ 0.4mg/ml，323U/mg)進(jìn)行灌流，消化時(shí)間約10min。最后，將心臟置于KB液中剪碎心室，用吸管輕輕吹打，用尼龍網(wǎng)過濾后用KB液(mmol· L－1:KOH 80;KCl 40;KH2PO425;MgSO43;Glutamic acid 50;Taurine 20;EGTA 0.5;HEPES 10;Glucose 10，pH值用 KOH調(diào)至7.2)保存細(xì)胞。

1.3.3 膜片鉗全細(xì)胞記錄方法［3］將分離獲得的心肌細(xì)胞置于浴槽中，用細(xì)胞外液(mmol·L－1:CsCl 107.5，NaCl 30，MgCl21，CaCl21，HEPES 20，Glucose 11，CoCl22，CsOH 調(diào) pH 至 7.35)灌流約10min。在倒置相差顯微鏡下選擇呈桿狀、橫紋清楚、立體感強(qiáng)、無皰疹、無收縮的細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄。玻璃微管電極經(jīng)三步拉制而成，充填電極液后阻抗在2～4 MΩ。電極內(nèi)液成分為:(mmol·L－1:CsF 135，NaCl 5，HEPES 5，EGTA 10，Mg-ATP 5，CsOH調(diào)pH至7.2)。通道電流信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器(Axopatch 200B)放大后，經(jīng)模/數(shù)(A/D)數(shù)模(D/A)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換后輸入計(jì)算機(jī)應(yīng)用Clamplex軟件采集儲(chǔ)存，采樣頻率20KHz，低通濾波2KHz，串聯(lián)阻抗補(bǔ)償70% ～80%，漏電流用“P/4”補(bǔ)償。高阻抗封接形成后給予短促負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，即形成全細(xì)胞模式，即可進(jìn)行鈉通道電流的記錄。膜片鉗實(shí)驗(yàn)在室溫20℃ ～25℃下進(jìn)行。為消除細(xì)胞間的誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用電流密度表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

動(dòng)作電位記錄實(shí)驗(yàn)觀察靜息電位水平(RP)、動(dòng)作電位幅度(APA)、動(dòng)作電位復(fù)極到50%和90%時(shí)程(APD50，APD90)。膜片鉗實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Clampfit軟件進(jìn)行處理，以 Sigmplot軟件作圖，通道電流幅度以電流密度表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位的影響

在1Hz的刺激頻率下，在穩(wěn)定記錄動(dòng)作電位20min后累加加入 10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L苦參堿(見Fig1)，每種濃度加藥時(shí)間為20min，可觀察到苦參堿濃度依賴性的延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程。從Table 1(n=8)統(tǒng)計(jì)結(jié)果觀察到，10μmol/L對(duì)動(dòng)作電位各參數(shù)沒有明顯作用，50μmol/L和100μmol/L能明顯延長(zhǎng) APD50和 APD90(P＜0.01)，100μmol/L能降低動(dòng)作電位幅度(P＜0.05)。

圖1 不同濃度苦參堿對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響

表1 苦參堿對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響

2.2 在Aconition作用下苦參堿對(duì)豚鼠心室乳頭肌動(dòng)作電位的影響

在正常臺(tái)式液中，記錄到穩(wěn)定動(dòng)作電位后加入1μmol/L Aconition10min后可觀察到動(dòng)作電位時(shí)程顯著延長(zhǎng)，動(dòng)作電位幅度稍有升高，在此基礎(chǔ)上分別加入 50μmol/L和 100μmol/L苦參堿 20min后，可觀察到動(dòng)作電位時(shí)程隨著苦參堿濃度的增加而逐漸減小，趨向于正常對(duì)照組，同時(shí)其動(dòng)作電位幅度稍下降。

2.3 苦參堿對(duì)鈉通道(INa)電流密度的影響

圖2 不同濃度苦參堿對(duì)烏頭堿誘導(dǎo)的豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響

記錄INa電極內(nèi)液用Cs+代替K+可防止鉀電流的干擾，細(xì)胞外液中加入 CoCl2可阻斷鈣電流。在室溫條件下，保持電位(holding potential HP)為－90mV，從 －90 mV去極化到 +30 mV，階躍為 +5 mV，持續(xù)時(shí)間為40ms的刺激方案下可記錄到一典型的內(nèi)向電流，該電流在－60 mV開始激活，在－45 mV時(shí)達(dá)到最大，之后電流逐漸減小，在+20 mV電流消失。該電流的電流-電壓關(guān)系圖呈鐘形。記錄到穩(wěn)定電流后，分別加入苦參堿10μmol/L、50μmol/L和 100μmol/L(Fig3)，觀察到苦參堿 10μmol/L 對(duì)INa沒有明顯作用，50μmol/L可使 INa減小，累加給藥到100μmol/L又使該電流增大，接近對(duì)照組電流密度，表現(xiàn)出苦參堿對(duì)心律失常的雙向作用。

圖3 苦參堿對(duì)豚鼠乳頭肌鈉通道(INa)電流密度的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在正常豚鼠心室乳頭肌細(xì)胞上，苦參堿能適度延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，且呈濃度依賴性。對(duì)APD90作用較明顯，對(duì) APA有減小作用，苦參堿在50μmol/L時(shí)可降低INa電流密度，在 －50mV～－35 mV作用較為明顯，但在100μmol/L時(shí)這種作用逐漸消失，表現(xiàn)為苦參堿對(duì)該通道具有雙向作用。

早在2002年黃彩云［1］應(yīng)用烏頭堿、氯化鋇、氯化鈣-乙酰膽堿混合液制備大鼠心律失常模型，觀察到15μmol/L和30μmol/L苦參堿均能對(duì)抗這幾種心律失常模型所致的室性心律失常，主要表現(xiàn)為降低心律失常的持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率，但確切的作用機(jī)制還不清楚，推測(cè)可能是通過改變心肌細(xì)胞膜鉀、鈣和鈉離子通道特性，降低心肌應(yīng)激性，延長(zhǎng)不應(yīng)期，從而抑制異位節(jié)律點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在正常心肌細(xì)胞上，苦參堿能濃度依賴性地延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，表現(xiàn)為適度延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程。烏頭堿為致心律失常藥物，能明顯延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，在此基礎(chǔ)上加入50μmol/L和100μmol/L，可使過度延長(zhǎng)的動(dòng)作電位時(shí)程適度減小，趨向于較為正常的動(dòng)作電位時(shí)程。這可能是苦參堿抗心律失常的作用機(jī)制，也是傳統(tǒng)中藥的一個(gè)特點(diǎn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與2004年 Shanhong LI［4］等在大鼠心室肌細(xì)胞上的結(jié)果相似，即能使心律失常狀態(tài)下的心肌細(xì)胞動(dòng)作電位趨于正常，改變心肌有效不應(yīng)期的不均一性。從抗心律失常的多靶點(diǎn)學(xué)說和最佳靶點(diǎn)學(xué)說可知［5］，有效的抗心律失常藥物是能夠作用于多靶點(diǎn)，內(nèi)向電流和外向電流達(dá)到平衡，表現(xiàn)為較為正常的動(dòng)作電位，因此認(rèn)為一個(gè)理想的抗心律失常藥物應(yīng)使動(dòng)作電位時(shí)程恢復(fù)致接近正常的水平?？鄥A在烏頭堿誘發(fā)心律失常的病變作用下表現(xiàn)為使動(dòng)作電位時(shí)程和動(dòng)作電位幅度恢復(fù)接近正常狀態(tài)，可能是苦參堿有效抗心律失常的機(jī)制之一。

鈉通道電流是誘發(fā)產(chǎn)生動(dòng)作電位的主要離子電流，該電流的異常將影響細(xì)胞的傳導(dǎo)性和興奮性，改變細(xì)胞的自律性，是抗心律失常的主要靶點(diǎn)。本研究觀察到，苦參堿在50μmol/L能明顯抑制 INa的電流密度，苦參堿濃度達(dá)到100μmol/L時(shí)這種抑制作用消失，表現(xiàn)為雙向的藥理作用，提示這種藥物在不同濃度下表現(xiàn)為不同的藥理作用。已有研究表明，烏頭堿［6］可使 INa通道持續(xù)開放，加速 Na+內(nèi)流，促使心肌細(xì)胞膜去極化而誘發(fā)心律失常。而本研究中觀察到，苦參堿具有抑制鈉通道電流的作用，這表明苦參堿能夠?qū)篂躅^堿所致的心律失常，可能與其對(duì)鈉通道的抑制作用相關(guān)。

單純苦參堿能夠延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，因此苦參堿的抗心律失常作用是多靶點(diǎn)的，對(duì)鈉通道、鈣通道及各種加通道均有一定的作用。已有研究顯示［7］，苦參堿與目前常用的抗心律失常藥物如胺碘酮相比，對(duì)各通道的作用相對(duì)緩和。在整體水平上［8］觀察到，苦參堿能對(duì)抗多種心律失常模型誘導(dǎo)的心律失常，表明這種相對(duì)緩和的藥理作用具有抗心律失常作用，這種相對(duì)較弱的作用能夠保證該藥物安全有效，且無毒副作用，因此揭示該藥的抗心律失常的作用機(jī)制，對(duì)開發(fā)該藥物的臨床應(yīng)用價(jià)值尤為重要。

［1］黃彩云，謝世榮，黃勝英.苦參堿抗心律失常作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24(3):176-179.

［2］李妙齡，曾曉榮，楊艷.多非利特與維拉帕米聯(lián)合應(yīng)用對(duì)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位的影響［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(5):834-838.

［3］李妙齡，曾曉榮，楊艷.一種改進(jìn)的人體心房肌細(xì)胞分離方法［J］.生理學(xué)報(bào)，2007，59(6):858-864.

［4］SHAN Hong-lI，YANG Bao-feng，ZHOU Yu-hong，et al.Effects of Matrine on Aconitine－Induced Electrophysiological Changes in Rat Ventricular Myocytes.［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences ，2004，13(3):193-198.

［5］楊寶峰，龔冬梅.抗心律失常藥物作用最佳靶點(diǎn)研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，18(1):1-5.

［6］汪玲芳，尹永強(qiáng)，趙臨.?；撬徭V對(duì)烏頭堿致大鼠心肌細(xì)胞心律失常模型鈉離子通道的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(5):611-614.

［7］許超千，董德利，杜智敏.苦參堿、小檗胺與胺碘酮、RP58866抗心律失常作用的比較［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(9):691-694.

［8］沈映君.中藥藥理學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1997:612.