蔡偉雄 李惠平 何少雄 何偉彬

1.廣東省博羅縣人民醫(yī)院檢驗科，廣東博羅 516100；2.廣東省博羅縣人民醫(yī)院感染科，廣東博羅 516100

目前全世界受HBV感染者接近20億，其中有超過3億的慢性感染者。在亞太地區(qū)，慢性HBV感染率超過10%，其中25%～40%的患者會因合并或不合并肝細胞癌的肝硬化而死亡。世界衛(wèi)生組織已將HBV感染列為全球十大死亡原因之一[1-3]。目前已建立對HBsAg、HBcAg及HBeAg及其抗體系統(tǒng)的檢測法。三種抗原體系統(tǒng)中以檢測HBsAg最為常用[4]。

為了進一步探明博羅地區(qū)慢性乙型肝炎感染者的基因型及其通過分子生物學來判斷他們的病情輕重，筆者取患者的血清進行了基因型的檢測及共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的定量測定工作，并通過統(tǒng)計軟件對二者的相關性進行統(tǒng)計學分析，以期為慢性乙型肝炎患者的診斷和治療提供參考和幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

筆者對廣東博羅地區(qū)2010年5月～2011年10月305例慢性乙型肝炎（CHB）患者行肝組織HBV cccDNA定量檢測。通過數(shù)據(jù)分析，探討患者肝組織中HBV cccDNA含量與患者的基因型的相關性，為臨床診斷和治療提供科學參考。所選患者當中，男242例，女63例；年齡15～54歲，平均（34.8±4.6）歲。以上患者院外半年內(nèi)均未行接受任何形式的抗病毒治療。將305例慢性乙型肝炎患者中隨機分為4組，即：A組95例，B基因型69例占72.6%，療程6個月，隨訪6個月；B組84例，B基因型62例占73.8%，療程9～30個月，平均（17.5±4.1）個月；C組77例，B基因型51例占66.2%，療程8個月，隨訪6個月；D組49例，B基因型38例占77.6%，療程9～24個月，平均（16.9±4.7）個月。各組慢性乙型肝炎患者的基本資料見表1。統(tǒng)計分析表明，表中多個樣本方差分析得4組的男女比例、年齡、HBV-DNA水平、基因型、基因亞型差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢查與治療方法

305例患者中，e抗原陽性的慢性乙型肝炎患者249病例，其中236例采用PCR-RFLP的方法測出基因型，另外13例擴增HBV S區(qū)直接測序，經(jīng)Pubmed BLAST比對得出HBV基因型、基因亞型。在已確定基因型的基礎上再進一步用PCR-RFLP法分基因亞型。249例慢性乙型肝炎患者中HBV B基因型172例占69.07%，C基因型77例占30.92%，未發(fā)現(xiàn)其他的基因型。B基因型中除一例沒有測出亞型，余均為Ba亞型，未見Bj亞型；C基因型中一個為C1和C2的混合亞型，余均為C2亞型。

HBV-DNA基因分型檢測也可以用ELISA法得以實現(xiàn)，主要是采用第一軍醫(yī)大學基礎部生物醫(yī)學診斷研究中心HBV基因分型微板核酸雜交試劑盒，對HBV2DNA定性檢測陽性標本進行基因分型。（1）取處理液100μL于0.5 mL離心管內(nèi)，加待測血清 100μL，混勻，100℃煮沸 15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液12μL于反應液管內(nèi)，彈勻，10 000 r/min離心10 s，上機，預變性94℃ 2 min；循環(huán)條件：94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 65 s，共循環(huán) 38 次，最后 72℃延伸 3 min（陰性、陽性參照同標本處理）。（2）取擴增產(chǎn)物變性，98℃ 10 min，迅速冰浴10 min。各取雜交液90μL、已變性產(chǎn)物20μL、各型核酸探針25μL分別加入反應孔內(nèi)，同時設空白對照（只加4滴雜交液及顯色探針25μL），輕輕搖動混勻，50℃水浴60 min，輕輕倒凈液體。（3）于每孔中加入雜交洗液200μL，50℃ 3～5 min，輕輕倒凈再重復洗2次。（4）每孔加顯色劑A、B各1滴，避光，置37℃ 10 min后加入終止液2滴，結果判定按P/N值（標本OD值/陰性參照OD值）＜3.0為陰性，P/N值≥3.0為陽性。常規(guī)肝穿刺取得肝組織，部分組織條放入高壓滅菌EP管內(nèi)，立即放入-70℃的冰箱內(nèi)保存。采用ligh tcycler核酸擴增儀行肝組織HBV cccDNA及肝組織HBV-DNA和血清HBV-DNA定量測定。HBV cccDNA檢測采用紹俊彬等設計的巢式PCR法。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，以α=0.05為作為檢驗的顯著性水平,計量資料兩指標間的相關性符合雙變量正態(tài)分布，用直線相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

表1 不同組慢性乙型肝炎患者HBV基因型和HBV cccDNA含量檢測結果相關性分析

對以上4組患者的HBV基因型和HBV cccDNA含量極性統(tǒng)計分析表明，二者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），即表明慢性乙型肝炎患的HBV基因型和HBV cccDNA含量的高低比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

乙型肝炎是病毒性肝炎中最常見，危害程度最大的一種。乙型肝炎病毒感染仍是威脅著人民健康的全球性問題。以放射免疫法及酶聯(lián)免疫法及酶聯(lián)免疫法最為敏感，其次為反向被動血凝及免疫粘附血凝法。免疫擴散與對流電泳法雖不甚敏感，但仍為我國廣泛采用。研究表明，慢性乙型肝炎患者患者血清中出現(xiàn)cccDNA是肝臟損害的標志，可以反應病情的輕重及病情的進展，同時也反應了實時熒光定量PCR法檢測CHB患者血清HBV cccDNA靈敏性較高、特異性強，可以應用于臨床來監(jiān)測乙型肝炎患者血清中cccDNA的水平及動態(tài)變化。HBV cccDNA含量是乙型肝炎病毒復制最特異的指標，其靈敏性和準確性都要超過目前常用的HBVDNA檢測。

乙型肝炎病毒是一種DNA病毒，HBV的形態(tài)分3種[5]。第1種類似于大球形顆粒，也稱Dane顆粒。Dane顆粒的中心部位就是環(huán)狀并且有缺口的DNA雙鏈，和依附在上面的DNA聚合酶。乙型肝炎病毒的基因組最引人注目的一個特征就是它非常小，其DNA分子大約含有約3 200個核苷酸，比已知的最大的病毒基因組小幾百倍，和人類擁有的基因組相比較，僅僅是百萬分之一。而且乙型肝炎病毒DNA的兩鏈長短不一，長鏈完整，長度恒定，為負鏈。短鏈是正鏈，長度可變，大概是長鏈的50%～80%。表面抗原和核心抗原都是由Dane顆粒的DNA編碼而來。

HBV基因組雖為雙鏈環(huán)形DNA，但其復制過程有RNA逆轉錄病毒的特性，需要逆轉錄酶活性產(chǎn)生RNA/DNA中間體，再繼續(xù)進行復制。其過程為：（1）在由病毒和（或）細胞來源的DNA-p作用下，正鏈首先延伸形成共價閉合環(huán)狀DNA。（2）以此為模板，通過宿主肝細胞酶的作用轉錄成復制中間體。（3）再以此為模板，通過逆轉錄酶的作用，形成第一代和第二代DNA。此雙鏈DNA部分環(huán)化，即完成HBV-DNA的復制。HBV突變株研究。由于HBV復制方式有其特殊性，即mRNA中間體進行逆轉錄過程中，由于缺乏校對酶（proofreading engymes）易發(fā)生HBV-DNA序列內(nèi)變異。（1）S區(qū)基因突變導致HBsAg亞型改變及血清HBsAg陰性、HBV-DNA陽性乙型肝炎，使臨床診斷困難。一些人接種乙型疫苗后產(chǎn)生抗-HBs，但仍可被HBV的S區(qū)基因突變株感染，而逃避宿主的免疫反應。（2）前C基因區(qū)突變與HBV感染后免疫及重型肝炎發(fā)病有關。一般認為乙型肝炎患者HBeAg轉陰，抗-HBe轉陽，表示HBV復制活躍程度減弱，臨床癥狀好轉。然而，一些患者當HBeAg轉陰后，仍有病毒復制及病情進行性發(fā)展，其血清中除檢出HBsAg和抗-HBe外，還可檢出HBV-DNA、抗-HBcIgM，肝內(nèi)HBcAg陽性，排除其他致肝損害的原因，提示病情變化與HBV有關。其特點為不易自然緩解，常發(fā)展為肝硬化，抗病毒治療反應差。經(jīng)研究表明，此類患者系感染了前C基因突變HBV突變株。（3）P區(qū)基因突變可致HBV復制減弱或停止。（4）X區(qū)基因突變可使HBxAg合成障礙。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)HBVA、B、C、D基因型可分為5種基因亞型，F(xiàn)基因型可細分為4種基因亞型，還有許多其他的基因亞型與重組型在不斷發(fā)現(xiàn)中。大量的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)HBV基因型、基因亞型的分布具有明顯地域性。我國乙型肝炎病毒主要以B、C基因型為主，另外有少量的A、D基因型分布，南方以B基因型多見，主要為Ba亞型；北方以C基因型多見，主要為C2亞型[6-8]。

乙型肝炎病毒具有高復制、高突變的特征，多年的自發(fā)突變導致形成多種基因型。本研究表明，慢性乙型肝炎患者HBV基因型和HBV cccDNA含量的高低差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。當全基因組核苷酸序列的差異超過8%時，被定義為一個基因型，應用該分型標準將HBV 分為A～H 8 種基因型。乙型肝炎病毒基因型間存在發(fā)病機制、療效反應和預后的差異，對乙型肝炎病毒感染者HBV基因分型有助于流行病學分析、臨床治療和預后判斷。

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