方永豐，李永生，彭云玲，王芳，王威，穆延召，王漢寧＊

（1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

玉米（Zea mays）在糧食生產(chǎn)、飼料及工業(yè)原料等方面發(fā)揮著重要作用，目前已成為世界上第一大糧食作物［1］。真菌性病害（如大小斑病、莖腐病、穗粒腐病等）及田間雜草嚴(yán)重危害玉米的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致玉米產(chǎn)量及品質(zhì)的下降，常規(guī)育種培育抗病玉米自交系周期長(zhǎng)、效率低，很難滿(mǎn)足生產(chǎn)需要。20世紀(jì)70年代興起的植物基因工程技術(shù)打破了物種之間基因交流的界限，可以將有利的外源基因?qū)胧荏w植物中，為作物遺傳改良帶來(lái)了新的途徑。但是，單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)一直發(fā)展緩慢。1987年Grimsley等［2］首先用農(nóng)桿菌將玉米條紋病毒（maize streak virus）的cDNA導(dǎo)入玉米幼苗分生組織或靠近生長(zhǎng)點(diǎn)的部位，98%的玉米葉片表現(xiàn)出病毒感染性狀，表明T－DNA已經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)玉米細(xì)胞，這一研究成果極大地推動(dòng)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究。1996年Ishida等［3］用超雙元載體轉(zhuǎn)化A188的幼胚，轉(zhuǎn)化率高達(dá)5%～30%，外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)，并且70%的轉(zhuǎn)基因植株可育，該實(shí)驗(yàn)有力地證明了農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植株與雙子葉植物具有相同的轉(zhuǎn)化機(jī)制，這是玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究中里程碑式的工作。玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)正日趨成熟，世界上有大批玉米轉(zhuǎn)基因新品系得到推廣種植，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益［4］。

目前常用的玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法有基因槍法［5］、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法［3］，花粉管通道法［6，7］等，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法由于成本低、操作方便而備受青睞。受體材料通常是幼胚或成熟胚的胚性愈傷組織，由于受基因型限制較大，生產(chǎn)上常用的優(yōu)良玉米自交系誘導(dǎo)愈傷困難，轉(zhuǎn)基因技術(shù)難以大規(guī)模推廣應(yīng)用，因此選擇取材方便且轉(zhuǎn)化不受基因型限制的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成為玉米轉(zhuǎn)基因研究的新方向。幼嫩莖尖的分生組織具有很強(qiáng)的分生能力，是玉米遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體，Sidorov等［8］用農(nóng)桿菌侵染由幼苗莖段誘導(dǎo)的愈傷組織，轉(zhuǎn)化率在2%～10%，這一研究突破了受體取材的季節(jié)限制，但莖段愈傷組織誘導(dǎo)明顯受基因型限制；Wang等［9］用農(nóng)桿菌侵染損傷的玉米莖尖分生組織，雖然最終轉(zhuǎn)化率為0.6%，卻具有不受季節(jié)及基因型限制、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化周期短等優(yōu)點(diǎn)，目前該方法已同時(shí)在棉花（Gossypiumspp.）［10］、小麥（Triticum aestivum）［11］、玉米［12－14］中得到應(yīng)用。

幾丁質(zhì)（聚乙酰胺基葡聚糖，chitin）和β－1，3－葡聚糖（β－1，3－glucan）是絕大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，而幾丁質(zhì)酶（chitinase，Chi，EC3.2.1.14）和β－1，3－葡聚糖酶（β－1，3－glucanase，Glu，EC3.2.1.39）分別催化二者的水解反應(yīng)。Mauch等［15］研究證實(shí)，β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶能夠協(xié)同抑制真菌生長(zhǎng)，他們分離并純化了豌豆（Pisum sativum）豆莢中的β－1，3－葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，經(jīng)過(guò)體外抑菌試驗(yàn)證實(shí)用這2種酶共同處理18種真菌之后，其中15種真菌的生長(zhǎng)受到抑制，國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究［16，17］也證實(shí)了這一點(diǎn)。Broglie等［18］首次從菜豆（Phaseolus vulgaris）中分離出幾丁質(zhì)酶基因，并將其置于花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana tabacum）和油菜（Brassica campestris），轉(zhuǎn)基因植株對(duì)猝倒病產(chǎn)生了一定的抗性；將幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶雙價(jià)基因?qū)胨荆∣ryza sativa）、棉花、煙草、小麥等作物，轉(zhuǎn)基因植株分別對(duì)稻瘟病、黃萎病、炭疽病和赤霉病等真菌性病害表現(xiàn)出一定的抗性［19－24］。目前將幾丁質(zhì)酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因同時(shí)轉(zhuǎn)入玉米尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用pbi121－Chi－linker－Glu－bar植物表達(dá)載體［25，26］，通過(guò)轉(zhuǎn)化骨干玉米自交系鄭58，以期獲得具有抗真菌、抗除草劑的玉米種質(zhì)新材料，同時(shí)為多基因共同轉(zhuǎn)化玉米提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米自交系鄭58（由甘肅富農(nóng)高科技種業(yè)有限公司提供），質(zhì)粒pbi121－chi－linker－glu－bar（圖1）及附有該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌工程菌LBA4404、EHA105及C58c1由本實(shí)驗(yàn)室保存。預(yù)混型DNA聚合酶（Premix Taq）、DL2000TMDNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，PCR檢測(cè)引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，Basta除草劑購(gòu)自西安羅森伯科技有限公司，乙酰丁香酮（AS）購(gòu)自Sigma－Aldrich公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

圖1 pbi121－ubi－chi－linker－glu－ubi－bar載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Diagram of plant expression vector pbi121－ubi－chi－linker－glu－ubi－bar

1.2 轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基

YEP培養(yǎng)基：牛肉膏10g／L、蛋白胨10g／L、氯化鈉5g／L（固體培養(yǎng)基加瓊脂15g／L），pH 值為7.0，121℃滅菌15min。萌發(fā)培養(yǎng)基：MS＋蔗糖20g／L＋瓊脂5.7g／L，pH值為5.8～6.0，121℃滅菌15min。重懸培養(yǎng)基：MS＋蔗糖20g／L＋葡萄糖10g／L＋水解酪蛋白0.2g／L，pH 值為5.1～5.5，121℃滅菌15min。

1.3 農(nóng)桿菌工程菌的制備

將附有載體的農(nóng)桿菌在含有利福平（50mg／L）和卡那霉素（50mg／L）的YEP固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)1～2 d，從平板上挑取單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600約為0.5）后在4 000r／min轉(zhuǎn)速、室溫下離心5min收集菌體，用重懸培養(yǎng)基稀釋至不同濃度，侵染前加入乙酰丁香酮（AS）。

1.4 除草劑篩選濃度的確定

將Basta除草劑配成50，100，200，500，1 000mg／L五種不同質(zhì)量濃度的水溶液，以蒸餾水作為空白對(duì)照，噴灑培養(yǎng)10d后長(zhǎng)勢(shì)一致的鄭58非轉(zhuǎn)基因植株，每個(gè)處理60株，以葉片掛液珠為準(zhǔn)，分別于第3，7，15天觀(guān)察葉片變化，統(tǒng)計(jì)植株存活率，以確定轉(zhuǎn)化植株的最佳篩選濃度。

1.5 轉(zhuǎn)化條件的選擇

農(nóng)桿菌菌液濃度選擇：用OD600為0.2，0.4，0.6，0.8及1.0的農(nóng)桿菌重懸液侵染10min，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率；農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的選擇：用OD600為0.6的農(nóng)桿菌對(duì)小苗莖尖分別侵染8～16min，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率；菌株的選擇：選用3個(gè)不同的菌株LBA4404、EHA105及C58c1的農(nóng)桿菌工程菌，菌液濃度OD600值為0.6，侵染10min，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率；乙酰丁香酮（AS）濃度的選擇：將重懸菌液中AS濃度分別調(diào)整為50，100，150及200μmol／L，菌株選擇LBA4404，用OD600為0.6的農(nóng)桿菌正常大氣壓下侵染10min，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率；當(dāng)農(nóng)桿菌LAB4404菌液濃度OD600值為0.6，AS濃度為100μmol／L時(shí)，分別在正常大氣壓（101kPa）和50kPa負(fù)壓下侵染10min，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率；以上各因素均以除草劑抗性植株百分?jǐn)?shù)作為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)化率（%）＝除草劑抗性植株數(shù)／移栽后成活植株數(shù)×100%，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及多重比較采用Excel 2010及SPSS 13.0完成。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化

挑選整齊飽滿(mǎn)的自交系種子，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒，依次為70%乙醇8min、升汞6min、無(wú)菌水洗滌3次，然后用加1.5倍種子體積無(wú)菌水室溫下浸泡4～6h后，再用升汞消毒10min、無(wú)菌水洗滌5次，放入底部墊有無(wú)菌濾紙并用無(wú)菌水浸濕的培養(yǎng)皿中，28℃黑暗條件培養(yǎng)3～4d直到種子出芽。將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)接至萌發(fā)培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)至芽長(zhǎng)為4～6cm時(shí)在超凈工作臺(tái)上剝離胚芽鞘和幼葉，露出莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，用手術(shù)刀輕微損傷莖尖用于轉(zhuǎn)化；將莖尖浸泡在農(nóng)桿菌重懸液中并置于真空干燥器中在50kPa的負(fù)壓下侵染；結(jié)束后用濾紙吸干種子上多余的菌液，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上23℃黑暗條件下培養(yǎng)3d，直至重新長(zhǎng)出新葉。

共培養(yǎng)結(jié)束后，將長(zhǎng)出新葉的轉(zhuǎn)化苗用溫水洗掉培養(yǎng)基和菌體，移栽到花盆后放入人工氣候室中，光照強(qiáng)度為500μmol／（m2·s），白晝溫度為27／22℃，光周期為12h／12h，濕度為65%。大約2周后用Basta除草劑噴灑葉片進(jìn)行篩選，10～15d后將存活的植株移栽至溫室中。

1.7 轉(zhuǎn)基因玉米植株的分子檢測(cè)

用CTAB法［27］小量提取抗性植株葉片DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度并稀釋至200ng／μL。以抗性植株葉片DNA為模板，用融合基因特異檢測(cè)引物CLG－F：GGGAGGCTTCTGCTGACAAG；CLG－R：TTTCCCAAACCAGCTTCACC（退火溫度55.7℃，產(chǎn)物大小607bp）及bar基因特異性檢測(cè)引物bar－F：GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC；bar－R：GCACCATCGTCAACCACTACAT（退火溫度61.3℃，產(chǎn)物大小440bp），載體質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照、非轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為陰性對(duì)照進(jìn)行降落PCR檢測(cè)［28］。PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5μL，上游引物（10μmol／L）1.0μL，下游引物（10μmol／L）1.0 μL，模板DNA 1.0μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。檢測(cè)融合基因Chi－Linker－Glu的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性35s，55.7℃退火40s，72℃延伸1min，10個(gè)循環(huán)；94℃變性35s，50.7℃退火40s，72℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃結(jié)束程序并保存。檢測(cè)bar基因的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸35s，10個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸35s，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃結(jié)束程序保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 除草劑最佳篩選濃度的確定

Basta為非選擇性廣譜除草劑，主要成分是草丁膦（phosphinothricin），其中L－草丁膦能夠強(qiáng)烈抑制谷胱甘肽合成酶（glutamine synthetase，GS，EC6.3.1.2）的活性，從而導(dǎo)致植物體內(nèi)由于氨基酸降解等過(guò)程產(chǎn)生的氨的毒性無(wú)法解除最終使植株死亡。噴施除草劑3d后，植株停止生長(zhǎng)，葉尖開(kāi)始變黃；7d后，噴施高濃度除草劑的植株有一半死亡，低濃度有部分死亡；15d后，噴施1 000，500及300mg／L Basta的植株全部死亡，噴施200，100及50mg／L Basta的植株存活率分別為4.5%，56.2%及86.8%（表1），而對(duì)照植株生長(zhǎng)正常，因此選用200mg／L Basta作為鄭58轉(zhuǎn)基因植株的最佳篩選濃度。

表1 不同濃度Basta對(duì)鄭58幼苗存活的影響Table 1 Effects of Basta with different concentration on the survival rate of Zheng58seedlings

2.2 菌液濃度和侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

菌液濃度和侵染時(shí)間是影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)下植物遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素，菌液濃度過(guò)低或過(guò)高，都會(huì)使轉(zhuǎn)化效率下降。采用不同濃度的農(nóng)桿菌重懸液對(duì)莖尖進(jìn)行侵染后，轉(zhuǎn)化效率呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖2），其中以O(shè)D600值為0.6時(shí)侵染效果最佳，平均轉(zhuǎn)化效率達(dá)到4.5%，與其他濃度相比存在極顯著差異（P＜0.01）。在最佳的菌液濃度下，選擇適當(dāng)?shù)那秩緯r(shí)間可以有效提高轉(zhuǎn)化效率，本試驗(yàn)設(shè)置6～14min共5個(gè)侵染時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)侵染6～14min其轉(zhuǎn)化率的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）（圖3），相比而言，侵染12min后其轉(zhuǎn)化效果最好。

圖2 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effects of bacterial concentration on transformation efficiency

圖3 侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effects of infection duration on transformation efficiency

圖4 不同菌株對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effects of different strains on transformation efficiency

圖5 AS濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.5 Effects of AS concentration on transformation efficiency

2.3 不同菌株對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

根癌農(nóng)桿菌可分為3大菌系，分別為胭脂堿型、章魚(yú)堿型以及琥珀堿型，不同菌系的菌株對(duì)植物的侵染能力有所不同。用3個(gè)不同菌系的農(nóng)桿菌侵染玉米莖尖，轉(zhuǎn)化效率之間的差異達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），其侵染能力從大到小依次為L(zhǎng)BA4404（章魚(yú)堿型）＞EHA105（琥珀堿型）＞C58c1（胭脂堿型），選用LBA4404和EHA105均可達(dá)到一定的轉(zhuǎn)化率，而選用C58c1的轉(zhuǎn)化效率較低（圖4）。

圖6 滲透壓力對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.6 Effects of osmotic pressure on transformation efficiency

2.4 乙酰丁香酮濃度及真空滲透對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化及表達(dá)受到酚類(lèi)物質(zhì)的誘導(dǎo)，而乙酰丁香酮是主要的創(chuàng)傷信號(hào)或創(chuàng)傷誘導(dǎo)因子，單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化困難的主要原因之一是由于細(xì)胞中不能積累足夠的酚類(lèi)物質(zhì)造成的［29］。將侵染液中乙酰丁香酮的濃度調(diào)整為150μmol／L時(shí)轉(zhuǎn)化效率較高（圖5），與其他濃度相比差異極顯著（P＜0.01）。在侵染的同時(shí)施以50kPa的負(fù)壓進(jìn)行真空滲透能顯著提高轉(zhuǎn)化效率（P＜0.01）（圖6）。

結(jié)果顯示，本試驗(yàn)中農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的最佳體系為L(zhǎng)BA4404菌液濃度OD600值為0.6、乙酰丁香酮濃度為150μmol／L、50kPa負(fù)壓下侵染12min。

圖7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化Fig.7 Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of maize shoot apical meristem.

圖8 抗性植株中融合基因Chi－Linker－Glu的PCR檢測(cè)Fig.8 PCR detection of fused gene Chi－Linker－Glu in resistant plants

圖9 抗性植株中bar基因的PCR檢測(cè)Fig.9 PCR detection of bar in resistant plants

2.5 遺傳轉(zhuǎn)化及T0代轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化各階段如圖7所示。CTAB法提取32株抗性植株葉片基因組DNA，以質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)植株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性對(duì)照，進(jìn)行降落PCR檢測(cè)（圖8，9）。結(jié)果顯示，有13株抗性植株分別在607和440bp附近擴(kuò)增出特異條帶，而未轉(zhuǎn)化植株沒(méi)有相應(yīng)條帶出現(xiàn)，抗性植株的PCR陽(yáng)性率為40%，采用莖尖遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化率為2.6%，初步證明外源目的基因已整合進(jìn)玉米基因組中。

3 討論

除草劑臨界濃度的確定對(duì)于轉(zhuǎn)化體篩選至關(guān)重要。蔣曉芳［30］、王琨等［31］用昌7－2和鄭58進(jìn)行除草劑臨界濃度篩選，確定的最佳濃度為200mg／L，本試驗(yàn)中確定的最佳篩選濃度也為200mg／L，其致死率為95.5%。對(duì)轉(zhuǎn)化植物的PCR檢測(cè)結(jié)果表明，使用該濃度進(jìn)行篩選后抗性植株陽(yáng)性率為40%，表明該臨界濃度會(huì)產(chǎn)生較多的假陽(yáng)性植株，但可以避免由于除草劑濃度過(guò)高而殺死部分陽(yáng)性植株造成轉(zhuǎn)化率降低。在遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)具體的受體材料基因型確定最適篩選濃度。

農(nóng)桿菌菌液濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的主要因素，菌液濃度過(guò)高，外植體上附著過(guò)多的農(nóng)桿菌，會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化植株的后期生長(zhǎng)；菌液濃度過(guò)低，外植體上農(nóng)桿菌附著不足，轉(zhuǎn)化效率低下［32，33］。本研究中菌液濃度以O(shè)D600值為0.6時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，這與孫傳波等［13］的研究結(jié)果一致。因?yàn)榇藭r(shí)的農(nóng)桿菌接近對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，侵染活力較強(qiáng)，同時(shí)在該濃度下進(jìn)行侵染對(duì)莖尖的傷害也較小，隨著菌液濃度增大，轉(zhuǎn)化植株在后期會(huì)出現(xiàn)心葉枯死，造成轉(zhuǎn)化效率下降，這可能是由于農(nóng)桿菌菌體密度較大，部分植株由于菌體附著過(guò)多導(dǎo)致過(guò)早死亡。鞏健和楊芳［12］的研究結(jié)果表明玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化侵染時(shí)間為5～10min均可，本研究選用6～14min共5個(gè)侵染時(shí)間進(jìn)行侵染后發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)延長(zhǎng)侵染時(shí)間可以有效提高轉(zhuǎn)化效率，隨著侵染時(shí)間的增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率有所提高，但以侵染12min后最佳。有研究表明［34］，單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化以附有超雙元載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404進(jìn)行侵染效果最好，本試驗(yàn)中采用不同農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行侵染，經(jīng)過(guò)除草劑篩選后也發(fā)現(xiàn)LBA4404轉(zhuǎn)化效率最高，C58c1最低。

目前報(bào)道的玉米遺傳轉(zhuǎn)化所用的外植體材料主要是幼胚和成熟胚及其愈傷組織，用于愈傷組織誘導(dǎo)的玉米材料僅限于A(yíng)188、HⅡ及其衍生品種，其中以HⅡ的幼胚愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率最高［35］。盡管如此，由于幼胚的取材受到季節(jié)限制而且玉米幼胚的離體培養(yǎng)基因型依賴(lài)性強(qiáng)，使得玉米遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用受到了限制。

以莖尖分生組織作為受體材料，由于莖尖分生組織在經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染后很容易再生出植株，避免了組織培養(yǎng)過(guò)程，同時(shí)克服了由于基因型障礙造成轉(zhuǎn)化植株再生困難的缺點(diǎn)，該方法可以作為改良國(guó)內(nèi)骨干玉米自交系中個(gè)別不良性狀的首選方法。采用莖尖遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)得到的T0代植株往往為嵌合體，因而不能在T0代進(jìn)行過(guò)多鑒定，PCR檢測(cè)只能初步證明外源基因是否整合進(jìn)植物基因組中，其整合特性還需采用分子雜交等方法對(duì)后代植株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定分析。

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