翟篤明，王松林，賈淞淋，郭成業(yè)

（1.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 胸心外科，吉林 長(zhǎng)春 130051；2.長(zhǎng)春市醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031）

中國(guó)人非小細(xì)胞肺癌B-RAF基因（V600E）突變的研究

翟篤明1，王松林2，賈淞淋1，郭成業(yè)1

（1.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 胸心外科，吉林 長(zhǎng)春 130051；2.長(zhǎng)春市醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031）

鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌性同源體B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因編碼的蛋白為 M a PK通路中的絲氨酸蘇氮酸蛋白激酶，該酶將信號(hào)從RAS轉(zhuǎn)導(dǎo)至EKI／2，從而參與調(diào)控多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等。BRAF在多種腫瘤存在突變，其中以結(jié)直腸癌突變率最高，突變率約為15%左右，在惡性黑色素瘤、肺癌、甲狀腺癌，肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的突變［1，2］。BRAF基因的突變位點(diǎn)主要位于基因的第15外顯子，其中約92%位于第1799位核苷酸上（T突變?yōu)锳），導(dǎo)致其編碼的谷氨酸被解氨酸取代（V600E）［3］。

在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factorreceptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase Inhibitors，TKIs）進(jìn)行的小分子靶向藥物（易瑞沙，特羅凱）治療的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：在K-RAS沒(méi)有突變的患者中也產(chǎn)生了針對(duì)靶向藥物的抗性，研究發(fā)現(xiàn)部分與B-RAF基因（V600E）突變有關(guān)［4］，因此在進(jìn)行肺癌靶向治療前進(jìn)行B-RAF基因突變的檢測(cè)對(duì)于判別治療藥物的敏感性有一定的指導(dǎo)意義。當(dāng)前對(duì)于B-RAF基因（V600E）在我國(guó)非小細(xì)胞肺癌組織突變的情況還未見(jiàn)研究報(bào)道，因此本研究針對(duì)160例非小細(xì)胞肺癌組織進(jìn)行突變檢測(cè)，并分析突變與臨床聯(lián)系，有助于篩選出適合非小細(xì)胞肺癌靶向治療的人群。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本資料

收集160例非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)后的石蠟標(biāo)本。在160例患者中，女性50例（31.25%），男性110例（68.75%）；年齡35歲－88歲，中位年齡為60歲；吸煙患者100例（62.50%），不吸煙患者60例（37.50%）；病理類(lèi)型：腺癌81例（50.63%），鱗癌64例（40.00%），腺鱗癌15例（9.47%）；Ⅰ期33例（20.63%），Ⅱ 期 32 例 （20.00%），Ⅲ 期 82 例（51.25%），Ⅳ期13例（8.12%）；腫瘤分化程度：低分化77例（48.13%），中、高分化83例（51.87%），所有病理學(xué)類(lèi)型及TNM分期均按照WHO標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 B-RAF基因（V600E）突變測(cè)序分析

應(yīng)用石蠟切片DNA提取試劑盒（FFPE gDNA miniPREP KIT，BIOMIGA）進(jìn)行腫瘤組織DNA提取。以提取的DNA為模板進(jìn)行B-RAF基因第15顯子擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為：上游引物：CCTCATCCTAACACATTCAAGCC， 下 游 引 物：CTTTCTAGTAACTCAGCAGCCATCTC，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為426bp。PCR反應(yīng)體系為20μl，包括：3.0μl DNA（0.2μg），1μl primer（10μmol），10μl 2×HotStart Taq PCR MasterMIX（北京天根公司），6μl DEPC-treated water。PCR 產(chǎn) 物 應(yīng) 用ABI3130型遺傳學(xué)分析儀測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增上游引物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Fisher’s檢驗(yàn)分析了K-RAS基因突變與性別、組織學(xué)類(lèi)型和吸煙狀態(tài)、分化程度及分期之間的關(guān)系，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 B-RAF基因（V600E）的突變檢測(cè)情況

通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所用檢測(cè)對(duì)象均可以擴(kuò)增出B-RAF基因的第15外顯子基因片段，其片段大小在426bp（結(jié)果見(jiàn)圖1A）。以PCR產(chǎn)物為模板，應(yīng)用ABI3130測(cè)序儀進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)的樣本內(nèi)檢測(cè)到B-RAF基因的野生型（GTG，V）以及突變型（GAG，E）分布，突變型均為雜合性突變（結(jié)果見(jiàn)圖1B，1C），在160例患者中，8例患者存在突變，占5%。

2.2 B-RAF基因突變同患者臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系

在8例發(fā)生B-RAF基因突變的患者中，6例為腺癌（6／81；7.14%），2例為鱗癌（2／84；3.12%）；7例為女性（7／50；14%），1例為男性（1／110；0.9%）；4例為吸煙者（4／100；4%），3例為非吸煙者（3／60；5%）。B-RAF基因突變同性別有關(guān)，女性患者突變率明顯高于男性。B-RAF基因突變與腫瘤細(xì)胞的分化有關(guān)，低分化腫瘤該基因的突變率明顯高于中高分化的腫瘤組織。該基因的突變與病理類(lèi)型、吸煙情況以及分期均無(wú)相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 B-RAF基因（V600E）的突變檢測(cè)結(jié)果

表1 BRAF基因突變與臨床特點(diǎn)關(guān)系

3 討論

B-RAF基因是1988年由Ikawa等首先在人類(lèi)尤因肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認(rèn)的。B-RAF基因位于7q34，編碼783個(gè)氨基酸的蛋白，在絕大多數(shù)組織和細(xì)胞類(lèi)型中，B-RAF是MEK／ERK最為關(guān)鍵的激活因子。B-RAF蛋白的主要功能為有絲蛋白激酶（MAPK）通路中的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，它將細(xì)胞表面的受體和RAS蛋白通過(guò)MEK和ERK與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接，激活多種因子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等。B-RAF基因突變主要有兩種類(lèi)型：（1）11%的突變位于外顯子11上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468等點(diǎn)突變；（2）89%的突變發(fā)生于外顯子15上的激活區(qū)，其中約92%位于第1 799位核苷酸上（T突變?yōu)锳），導(dǎo)致其編碼的纈氨酸由谷氨酸取代（V600E）。激酶激活后活性比野生型B-RAF提高500倍。突變后的B-RAF持續(xù)性激活 MAPK通路，使前有絲分裂原有效分裂能力增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和分化［5］。

國(guó)外的研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌的患者腫瘤組織內(nèi)存在部分的B-RAF基因突變。其突變率大約在3%左右［6］。B-RAF突變與非小細(xì)胞肺癌患者的生存率有一定的關(guān)系，具有B-RAF基因突變的患者預(yù)后較差［7］。在本研究檢測(cè)的非小細(xì)胞肺癌患者的B-RAF突變發(fā)現(xiàn)，B-RAF的突變與性別有關(guān)，女性突變的比例明顯高于男性，而我國(guó)學(xué)者在進(jìn)行大規(guī)模人群EGFR測(cè)序以及靶向分子藥物治療相關(guān)性中得到的研究結(jié)論是在非小細(xì)胞肺癌的患者中性別為女性、不吸煙以及病例類(lèi)型為腺癌的患者其EGFR突變率較高，更適合應(yīng)用靶向藥物治療［8，9］。而本研究中發(fā)現(xiàn)的女性的B-RAF突變率較高，突變率在病理類(lèi)型以及是否吸煙沒(méi)有差異。同時(shí)以往的研究表明B-RAF突變可與EGFR基因的突變同時(shí)存在，而B(niǎo)-RAF突變的患者將不會(huì)從EGFR靶向治療藥物中獲益。因此在進(jìn)行針對(duì)EGFR進(jìn)行靶向分子治療過(guò)程中，應(yīng)事先進(jìn)行B-RAF突變的檢測(cè)。

當(dāng)前針對(duì)B-RAF（V600E）突變的腫瘤靶向藥物已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床研究，顯示良好的臨床效果以及 較 低 的 毒 副 作 用［10，11］。 因 此 針 對(duì) B-RAF（V600E）突變的腫瘤患者在不能應(yīng)用針對(duì)EGFR靶向分子治療的同時(shí)，也可以應(yīng)用針對(duì)B-RAF（V600E）突變的靶向藥物。通過(guò)針對(duì) B-RAF（V600E）突變的檢測(cè)不僅進(jìn)一步豐富了非小細(xì)胞肺癌的分子分型研究，同時(shí)也為其治療提供新的治療靶點(diǎn)與策略。

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