張 峰，趙 潔，曲銀娥

（1.河北大學衛(wèi)生職業(yè)技術學院，河北 保定 071000；2.唐山市婦幼保健院 婦產(chǎn)科；3.河北聯(lián)合大學基礎醫(yī)學院）

COMT基因Met多態(tài)與子宮內(nèi)膜異位癥的關系

張 峰1，3，趙 潔2，曲銀娥3＊

（1.河北大學衛(wèi)生職業(yè)技術學院，河北 保定 071000；2.唐山市婦幼保健院 婦產(chǎn)科；3.河北聯(lián)合大學基礎醫(yī)學院）

目的 探討COMT基因Met多態(tài)與子宮內(nèi)膜異位癥的關系。方法采用蛋白酶K消化-飽和酚氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA，聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法分別對120例子宮內(nèi)膜異位癥患者（內(nèi)異癥組，含59例腺肌病患者）和65例非內(nèi)異癥及腺肌病女性（對照組）進行COMT基因分型。結(jié)果（1）內(nèi)異癥組和對照組 G／G、G／A和 A／A基因型頻率分別為17.5%、43.3%和39.2%，9.2%、50.8%和40.0%，差異無統(tǒng)計學意義；內(nèi)異癥組和對照組A等位基因頻率分別為27.1%和29.2%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義；（2）G／A、A／A基因型個體發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥的相對危險度分別為G／G型個體的0.516倍（0.185-1.441，P＞0.05）和0.450倍（0.165-1.232，P＞0.05），差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論COMT基因 Met多態(tài)與子宮內(nèi)膜異位癥無相關性。

COMT基因；多態(tài)性；子宮內(nèi)膜異位癥

子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥，endometriosis，EMs）是育齡期婦女的多發(fā)病和常見病，發(fā)病率呈明顯增高趨勢，因其易侵襲、高復發(fā)，嚴重影響婦女的身心健康。EMs為雌激素依賴性疾病［1，2］，且與候選基因的多態(tài)性相關，基因多態(tài)性影響酶活性，可以造成內(nèi)異癥的個體差異。COMT基因為雌激素代謝解毒的關鍵酶，其單核苷酸多態(tài)可能改變酶活性和含量，進而影響雌激素代謝，改變個體對內(nèi)異癥的易感性。本研究應用PCR-RFLP技術檢測了120例內(nèi)異癥患者和65例對照人群COMT基因第158位密碼子G-A單核苷酸多態(tài)，旨在探討COMT基因Met多態(tài)與子宮內(nèi)膜異位癥的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2007年3年-2009年2月保定市第三醫(yī)院剖腹或腹腔鏡手術的子宮內(nèi)膜異位癥患者120例（內(nèi)異癥組，含59例子宮腺肌?。?，所有標本均經(jīng)病理學證實；隨機選擇同期在此院體檢的65例健康女性為對照組。內(nèi)異癥組31.67±2.6歲，對照組30.9±3.2歲，2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。月經(jīng)周期規(guī)律，無其它內(nèi)外科及內(nèi)分泌疾病，排除家族性遺傳疾病如糖尿病、高血壓等疾病，術前3個月無服用激素類藥物及免疫抑制類藥物。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及PCR擴增 檸檬酸鈉抗凝的空腹靜脈血5ml，蛋白酶K消化-苯酚法提取外周血基因組DNA，－70℃保存。根據(jù)Genebank基因序列，設計引物，F(xiàn)：5′-TCGTGGACGCCGTGATTCAGG-3′，R：5′-AGGTCTGACAACGGGTCAGGC-3′，片段大小為217bp，由北京賽百盛公司合成。PCR-RFLP方法進行基因分型，25μl反應體系：10×PCR buffer 2.5μl、去離子水8.3 μl、上下游引物各5μl（20μM）、Taq聚合酶0.2μl（5U／μl）、dNTPs 2μl、模板 DNA 2μl（20ng／μl）。反應程序：94℃預變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環(huán)，末次循環(huán)后，72℃延伸5min。

1.2.2 酶切分析和基因型鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NlaⅢ酶切，37℃過夜。20μl酶切體系：10×NE buffer 2μl、雙蒸水12.3μl、NlaⅢ0.5μl（10U／μl）、100×BSA 0.2μl、PCR產(chǎn)物5μl。酶切產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度40g／L瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，確定基因型。

1.2.3 序列分析 隨機選擇COMT三種基因型PCR產(chǎn)物，送北京賽百盛公司進行測序驗證。等位基因頻率＝（2×純合子數(shù)＋雜合子數(shù)）／（2×受檢人群）。

1.2.4 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶NlaⅢ、dNTP和TaqDNA聚合酶均購自英格蘭Biolabs公司，PCR擴增試劑盒購自加拿大Sangon公司，COMT引物由北京賽百盛公司合成，凝膠電泳成像系統(tǒng)（FUJI FILM公司）。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，基因型和等位基因頻率采用基因直接計數(shù)法計算，χ2檢驗比較各組間基因型分布及等位基因頻率，非條件Logistic回歸計算比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（95%CI），確定基因型與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的關聯(lián)強度。

2 結(jié)果

2.1 COMT基因型檢測結(jié)果

隨機抽取PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，217 bp處可見清晰條帶，與預期的COMT基因第158位單核苷酸多態(tài)擴增片段長度相符，表明所得PCR產(chǎn)物為目的基因（圖1）。經(jīng)NlaⅢ酶切后，COMT基因野生純和型（G／G）為81bp和136bp 2個片段，突變雜合型（G／A）為40bp、81bp、96bp和136 bp 4個片段，突變純合型（A／A）為40bp、81bp和96bp3個片段。電泳時40bp因片段過小而泳出。因此，在紫外燈下觀察結(jié)果時，G／G顯示81bp、136 bp 2條帶，G／A 顯示81bp、96bp、136bp 3條帶，而A／A顯示81bp、96bp 2條帶（圖2）。

圖1 COMT基因PCR產(chǎn)物

2.2 COMT基因多態(tài)與內(nèi)異癥的關系

內(nèi)異癥組和對照組G／G、G／A和A／A基因型頻率 分布 為 17.5%、43.3% 和 39.2%，9.2%、50.8%和40.0%，差異無統(tǒng)計學意義（表1）；A等位基因頻率分別為27.1%和29.2%，差異均無統(tǒng)計學意義（表2）。病例組和對照組各基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg定律。

圖2 COMT基因型圖譜

表1 2組COMT基因型頻率比較（例數(shù)）

表2 2組A等位基因頻率比較 （%）

2.3 COMT各基因型的相對危險度分析

非條件Logistic回歸分析結(jié)果顯示：G／A、A／A基因型個體發(fā)生內(nèi)異癥的相對危險度分別為G／G基因型個體的0.516倍和0.450倍，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示COMT基因多態(tài)與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生無關（表3）。

表3 COMT三種基因型相對危險度分析

3 討論

內(nèi)異癥是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮體以外的部位，其病因和發(fā)病機制均不明［3］。內(nèi)異癥是一種雌激素依賴性疾病，其發(fā)生發(fā)展與雌激素密切相關［4］，雌激素的量或代謝異?？赡苷T導子宮內(nèi)膜某部分生長失控而發(fā)生內(nèi)異癥。

兒 茶 酚-O-甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （Catechol-O-Methyl transferase，COMT）是雌激素代謝解毒的關鍵酶，催化兒茶酚雌激素甲基化為甲基雌二醇，將雌激素及其代謝物轉(zhuǎn)化為無毒的代謝產(chǎn)物排出體外，對雌激素的致癌效應起主要防御作用。人類COMT基因第158位密碼子G-A單核苷酸多態(tài)可以降低COMT酶的活性，由突變純合子編碼的COMT酶活性下降至野生純合子編碼的1／3-1／4［5］。雌激素及雌激素代謝產(chǎn)物積聚，可能增加雌激素依賴性疾病的發(fā)生風險。我們的實驗結(jié)果顯示，內(nèi)異癥組與對照組之間，COMT基因的G／G、G／A和A／A基因型頻率及A等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義，158位密碼子G-A單核苷酸突變未增加內(nèi)異癥的患病風險，提示COMT基因158Met多態(tài)性可能與內(nèi)異癥遺傳易感性無關。長期以來COMT基因被認為是精神心理疾病的易感基因，近年來用于與雌激素代謝有關疾病研究。目前，有關COMT基因多態(tài)與內(nèi)異癥易感性的報道結(jié)果并不一致。Huber［6］等研究發(fā)現(xiàn)奧地利維也納白種人內(nèi)異癥患者和健康對照者COMT基因多態(tài)與內(nèi)異癥之間無明顯相關性。劉萌［7］則發(fā)現(xiàn)COMT基因突變純合子能夠顯著降低內(nèi)異癥的發(fā)病風險。Juo［8］等報道COMT基因G-A純合突變使COMT酶活性降低，是子宮腺肌癥的危險基因型，但與內(nèi)異癥無明顯相關性。推測出現(xiàn)上述結(jié)果的原因，一方面可能所選擇的研究對象臨床分期不同、疾病嚴重程度不同、種族及地域等不同，而內(nèi)異癥的發(fā)病與上述因素有關；另一方面可能因為雌激素合成與代謝涉及雌激素代謝通路的其他基因多態(tài)，對COMT基因的作用產(chǎn)生不同的影響，使COMT酶在雌激素合成與代謝的不同階段活性不同，具體機制尚需進一步研究。

［1］Simpson L J，Bischoff F Z.Heritability amd molecular genetic studies of endometriosis［J］.Ann N Y Acad Sci，2002，（955）：239.

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Study on the correlation between gene polymorphism of COMT and endometriosis

ZHANGFeng，ZHAOJie，QUYine.（HealthCollegeofHebeiUniversity.Baoding071000，China）

ObjectiveTo explore the correlation between gene polymorphism of Catechol-O-Methyltransferase（COMT）and endometriosis（EMs）.MethodsPolymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）was used to analyze the polymorphism of COMT gene in 120patients with endometriosis（59with adenomyosis）and 65healthy controls.ResultsThere was no significant difference of the frequence of A allele and the distribution of genotype between EMs group and control group.The relative risk suffered from endometriosis of G／A and A／A genotype was 0.516（0.185-1.441）and 0.450（0.165-1.232）times of the G／G genotype respectively.ConclusionThere was no correlation between the Met gene polymorphism of COMT and endometriosis.

COMT；Gene polymorphism；Endometriosis（ChinJLabDiagn，2012，16：0301）

R711.71

A

1007－4287（2012）02－0301－03

河北省教育廳科技支撐項目（2009468）；保定市科學技術研究與發(fā)展計劃項目（11ZF134）

＊通訊作者

張峰（1974-），男，碩士研究生，主要研究方向：生殖生物學。

2010－11－26）