金建國(guó)，馬作新

（1.撫順市中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 撫順 113008；2.遼寧省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110016）

乙型肝炎患者HBVDNA及AMA檢測(cè)與肝臟纖維化相關(guān)性的研究

金建國(guó)1，馬作新2

（1.撫順市中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 撫順 113008；2.遼寧省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110016）

目的 探討乙肝病毒DNA（HBV DNA）、抗線粒體抗體（AMA）與肝臟纖維化之間的相關(guān)性及臨床應(yīng)用價(jià)值。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)HBV DNA；用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原蛋白（PCⅢ）及Ⅳ型膠原蛋白（CIV）的檢測(cè)；分別采用間接免疫熒光法及免疫印跡法檢測(cè)抗線粒體抗體（AMA）及其M2型抗體。結(jié)果將每組的肝纖維化指標(biāo)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：HBV DNA濃度大于103copies／ml且小于105copies／ml組（A組）與HBV DNA濃度大于105copies／ml（B組）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；B組與HBV DNA濃度大于105copies／ml且AMA陽性組（D組）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，A、C組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論1.LN、HA、PCⅢ、CIV能夠很好的反映肝纖維化進(jìn)展?fàn)顩r，指導(dǎo)臨床治療。2.HBV DNA活躍復(fù)制且伴有抗線粒體陽性者較僅HBV DNA陽性者更易發(fā)生肝臟纖維化。

HBV DNA；AMA；肝臟纖維化

（ChinJLabDiagn，2012，16：0278）

我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，據(jù)全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查資料，乙肝病毒（HBV）感染率為5%－18%。慢性乙型肝炎10%－20%可發(fā)展為肝硬化，1%－5%可演變?yōu)楦伟瑢?duì)人類健康危害極大［1］。慢性乙型肝炎的轉(zhuǎn)歸受病毒本身因素、宿主免疫因素及治療方案等多種因素綜合影響，肝組織學(xué)檢查是診斷肝纖維化等肝病轉(zhuǎn)歸狀況評(píng)價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于此檢查屬有創(chuàng)檢查，患者依從性較差，臨床上難以將肝穿刺活體組織學(xué)檢查作為常規(guī)檢查手段。肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原蛋白（PCⅢ）、Ⅳ型膠原蛋白（CIV）是反應(yīng)肝纖維化的有效指標(biāo)，且二者量化關(guān)系較好，使醫(yī)生在無肝組織學(xué)檢查情況下用血清學(xué)指標(biāo)來推斷肝組織的纖維化程度成為可能。此外，據(jù)報(bào)道，另一種可致肝纖維化的疾病——原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）的發(fā)病率約為（2－24）／10萬，年發(fā)病率約為（0.4－3）／10萬，而且呈逐年增長(zhǎng)的均勢(shì)［2］。而在PBC的診斷中，抗線粒體抗體（AMA）是一個(gè)很有價(jià)值的指標(biāo)，95%以上的PBC病人可以檢測(cè)到AMA，尤其是AMA-M2，但是，在正常人群中也可檢測(cè)到低滴度的AMA，而在靶細(xì)胞——膽管內(nèi)皮細(xì)胞中靶抗原的表達(dá)與mRNA的表達(dá)不平行，所以，迄今為止還沒有證據(jù)表明AMA是真正的自身抗體或是與細(xì)菌、病毒或外源生物相關(guān)抗原交叉反應(yīng)的抗體［3］。在臨床標(biāo)本中也會(huì)經(jīng)常檢測(cè)到低滴度的AMA，尤其在乙肝陽性的一些患者中，為探討HBV DNA、AMA與肝纖維化進(jìn)展程度是否存在一定的相關(guān)性，我們進(jìn)行了如下的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本來源 256例來自我院2006年至2008年門診及住院患者標(biāo)本。根據(jù)其HBVDNA濃度及AMA熒光表現(xiàn)進(jìn)行分組：A組為117例1×103copies／ml＜HBVDNA＜1×105copies／ml及AMA陰性乙肝患者；B組為HBV DNA＞1×105copies／ml的83例患者；C組為32例1×103copies／ml＜HBV DNA＜1×105copies／ml且AMA陽性滴度在1∶100與1∶320之間的患者；D組為 HBV DNA＞1×105copies／ml且AMA陽性滴度同樣在1∶100與1∶320之間的24例患者；另設(shè)健康對(duì)照組為30例健康體檢合格者。

1.1.2 主要儀器 Roche公司生產(chǎn)的lightcycler熒光定量PCR儀；北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)的 YDME JETLIA-962型化學(xué)發(fā)光儀；OLYMPUS的BX50熒光顯微鏡；上海科華公司的KHB ST-360型酶標(biāo)儀。

1.1.3 主要試劑 深圳匹基公司的熒光定量PCR試劑盒；北京源德公司的肝纖維化四項(xiàng)試劑包括LN、PⅢNP、IVC、HA試劑盒；德國(guó)歐蒙公司抗核抗體檢測(cè)試劑及AMA-M2的檢測(cè)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HBVDNA的檢測(cè) 按試劑盒說明書操作。

1.2.2 肝纖四項(xiàng)檢測(cè) a IV 型膠原、PIIINP、LN檢測(cè)：利用化學(xué)發(fā)光雙抗體夾心法原理檢測(cè)人體血清中IV型膠原、PIIINP、LN的含量。b血清中HA檢測(cè)：利用化學(xué)發(fā)光競(jìng)爭(zhēng)法原理檢測(cè)人體血清中HA的含量。

1.2.3 免疫印跡法檢測(cè)AMA-M2 按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

對(duì)不同組別的標(biāo)本分別進(jìn)行 HA、PCⅢ、IVC及LN等4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)的檢測(cè)，所測(cè)結(jié)果見表1。所測(cè)四項(xiàng)肝纖指標(biāo)的正常參考范圍分別為：LN＜130ng／ml、PCⅢ＜120ng／ml、IVC＜120ng／ml、HA＜120ng／ml健康對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均在參考范圍內(nèi)，其余4組均有不同程度的增高。對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：A、B組比較（P＜0.01）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B、D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各組與對(duì)照組比較均有顯著差異（P＜0.01）；此外，A、C組進(jìn)行比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中C、D組均存在低滴度的AMA陽性，同樣也對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的免疫印跡檢測(cè)，僅個(gè)別幾例患者檢出抗線粒體M2型抗體弱陽生，由于樣本例數(shù)較少未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，只提示個(gè)別病例有進(jìn)一步發(fā)展為原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）的可能。

表1 5組測(cè)試者肝纖維化檢測(cè)結(jié)果

3 討論

肝纖維化是由各種因素引起肝細(xì)胞脂肪變、壞死及炎癥后，進(jìn)而在壞死區(qū)發(fā)生膠原纖維增生，細(xì)胞外基質(zhì)過度增生和沉積而形成。目前能反映肝纖維化的指標(biāo)較多，臨床中應(yīng)用HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C較多。HA是一種蛋白多糖，是構(gòu)成肝細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，可被肝竇內(nèi)皮細(xì)胞攝取、降解，肝細(xì)胞受損可影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，使血清HA含量升高；LN是主要的基底膜糖蛋白，在肝纖維化發(fā)展過程中，LN沉積于Dissee空隙，用于形成完整的內(nèi)皮細(xì)胞基底膜，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［4］，其與肝纖維化形成有重要關(guān)系，是門脈高壓發(fā)生的主要基礎(chǔ)，血清LN水平常與IV-C、HA相平行；IV-C組成肝內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的功能性基底膜，肝纖維化時(shí)基底膜的形成和破壞均增加，致使血清IV-C水平升高。細(xì)胞外基質(zhì)主要以膠原蛋白為基本結(jié)構(gòu)，肝纖維化時(shí)膠原細(xì)胞增生和活化，Ⅲ型膠原合成增加，導(dǎo)致血清PCⅢ水平升高。

本研究顯示，HBV DNA＞1×105copies／ml組（B組）較之DNA濃度介于103及105cipies／ml的A組，更易于發(fā)生肝纖維化（P＜0.01），說明了病毒的活躍復(fù)制對(duì)肝病的進(jìn)程有所影響；而另一合并有抗線粒體抗體且HBV DNA大于105cipies／ml的D組與B組比較起來更促進(jìn)了疾病的發(fā)展（P＜0.01）；但同樣是病毒的低復(fù)制狀態(tài)的 A、C組，AMA的存在就未對(duì)肝纖維化程度有所影響，這也說明了低滴度抗線粒體對(duì)不同病毒復(fù)制狀態(tài)的組群影響是不一致的，有待于對(duì)大樣本分析。

對(duì)于與慢性乙型肝炎殊途同歸即同樣可導(dǎo)致肝纖維化，進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化的疾病——PBC，AMA抗體在其診斷中所起的作用也同樣受到研究人員的關(guān)注。2000年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)PBC診斷指導(dǎo)建議［5］診斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）堿性磷酸酶等反映膽汁瘀積的生化指標(biāo)升高；（2）B超或膽管造影示膽管正常；（3）抗線粒體抗體或 AMA-M2陽性；（4）若血清AMA或AMA-M2陰性，病理檢查需符合PBC改變。因此從這一標(biāo)準(zhǔn)看來，本文所選病例均非原發(fā)性膽汁性肝硬化，至多數(shù)年后發(fā)展為PBC的可能性要大些，但在促進(jìn)肝病的發(fā)展中卻起到了一定的作用，這可能與其免疫機(jī)制相關(guān)?？咕€粒體抗體存在9種亞型，其中主要的相關(guān)抗原有丙酮酸脫氫酶E2亞基（PDC-E2）。2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體（OGDC）、支鏈2-氧酸脫氫酶復(fù)合體的E2亞基、亞硫酸鹽氧化酶及糖原磷酸化酶等，所以若存在抗線粒體抗體可對(duì)肝臟的氧化磷酸化過程有一定影響，存在著促進(jìn)肝纖維化的可能。

此外，TNF-α可以誘導(dǎo) TNF、IL-1及IL-6的產(chǎn)生，增加HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗原表達(dá)，促進(jìn)B、T細(xì)胞增殖及免疫球蛋白的合成，具有廣泛的誘導(dǎo)炎癥和免疫調(diào)節(jié)功能，據(jù)報(bào)道［6］AMA的存在可使TNF-α在體外生成減少，提示其為病毒大量復(fù)制提供了一定的免疫學(xué)條件；IL-10由Th2型CD4＋T細(xì)胞分泌，是一個(gè)重要的抑制因子，能夠調(diào)控前炎Th1細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)，因此IL-10在維持自身免疫耐受性中具有重要作用，抗線粒體抗體與Th1細(xì)胞有關(guān)，IL-10分泌的下降可導(dǎo)致耐受下降、自身反應(yīng)Th1型CD4＋T細(xì)胞異常激活，這也使C組與對(duì)照組之間比較存在著顯著性差異（P＜0.01）。

成熟的CD8T淋巴細(xì)胞是清除HBV的主要效應(yīng)細(xì)胞，CD8T淋巴細(xì)胞刪除可導(dǎo)致持續(xù)性HBV感染［7］。由于急性乙型肝炎（AHB）患者 體內(nèi)存在強(qiáng)烈而多特異的CTL反應(yīng)，因此能徹底清除體內(nèi)的HBV，使AHB患者完全康復(fù)。相反，在慢性肝炎患者中，抗病毒的免疫反應(yīng)太弱而不足以控制和清除病毒，相反卻能觸發(fā)并維持持續(xù)的壞死性炎癥，使細(xì)胞內(nèi)部抗原持續(xù)暴露也是產(chǎn)生AMA的一個(gè)誘因之一，肝細(xì)胞在不斷壞死不斷修復(fù)中也促進(jìn)了纖維化的進(jìn)程。

據(jù)研究［8］，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞是一群專職的主動(dòng)抑制針對(duì)自身抗原或外來抗原的免疫反應(yīng)T淋巴細(xì)胞。其特點(diǎn)是特異性地表達(dá)FoxP3（forkhead／winged helix transcription factor）。在CHB狀態(tài)下，Treg影響了針對(duì)病原的特異性細(xì)胞免疫功能，最終可能影響疾病進(jìn)程。近期發(fā)現(xiàn)，Treg可抑制HBV抗原介導(dǎo)的自體PBMC增殖，反映出可能有HBV抗原特異性Treg的產(chǎn)生，刪除Treg后可增強(qiáng)HBV特異性T淋巴細(xì)胞的功能［9］。因此Treg的上調(diào)也降低了對(duì)AMA的反應(yīng)，研究表明，Treg細(xì)胞在整個(gè)HBV感染所導(dǎo)致的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。隨著HBV感染進(jìn)程的發(fā)展，一方面Treg抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能，另一方面，不論是外周血Treg頻率，還是肝組織浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量均逐漸增加，并且與病毒復(fù)制向慢性肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)展以及患者的生存時(shí)間相關(guān)［10］。所以從這些因素也可以在一定程度上解釋在病毒活躍復(fù)制及AMA陽性病例中肝纖維化指標(biāo)顯著升高的原由。

1979年首次完成HBV DNA的克隆化之后，隨著對(duì)更多的HBV DNA全基因或基因片段的克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)不同患者感染的HBV DNA序列存在差別，而且不同基因序列的HBV感染機(jī)體后產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的性質(zhì)也存在顯著的差別，因此，根據(jù)HBV感染之后抗體應(yīng)答性質(zhì)的差別，將HBV分成不同的血清型（serotype）；根據(jù)HBV DNA基因序列的不同，將 HBV分成不同的基因型（genotype）。實(shí)際上，每一個(gè)患者血清中都存在大量拷貝的HBV，每一拷貝的HBV DNA序列不盡相同，表現(xiàn)出準(zhǔn)種（quasispecies）的特點(diǎn)［11，12］。準(zhǔn)種的概念強(qiáng)調(diào)的是遺傳學(xué)特點(diǎn)高度相關(guān)又有不同，同時(shí)在自身和外界因素的影響下優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)種群的構(gòu)成又處于不斷變化之中［13］。在一部分HBV DNA低滴度及高復(fù)制的乙肝患者血清中所檢測(cè)到的AMA也可能是HBV某一準(zhǔn)種的交叉抗體，在HBV DNA低復(fù)制狀態(tài)中AMA的協(xié)同作用有可能未對(duì)肝纖維化進(jìn)程有所影響，所以表現(xiàn)出A、C兩組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

肝纖維化及早期肝硬化可逆轉(zhuǎn)，其中早期肝硬化經(jīng)治療逆轉(zhuǎn)率達(dá)75%，故早期診斷對(duì)延緩肝硬化病程，甚至逆轉(zhuǎn)起重要作用。研究顯示［14］，HA隨著慢性肝炎病程的進(jìn)展而逐漸升高，尤其在慢性肝炎重度階段和肝硬化時(shí)升高最為顯著，是判斷肝纖維化程度的敏感指標(biāo)；血清PCⅢ在慢性肝炎加重階段合成最活躍，但在肝硬化階段PCⅢ合成減慢［16］；CⅣ與HA在肝纖維化發(fā)展病程中有很好的相關(guān)性，能較好地反映肝纖維化早期病變，另外，血清LN對(duì)晚期肝纖維化程度及肝硬化的診斷意義較大［14］。本研究也表明，各實(shí)驗(yàn)組，此四項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)與健康對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），只是升高的程度有所不同，所以在病程初期就應(yīng)積極用藥，對(duì)D組的情況應(yīng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)其對(duì)治療的反應(yīng)程度，以調(diào)整用藥的種類及劑量。

抗病毒治療是目前對(duì)慢性HBV感染的主要治療措施。當(dāng)前主要有5種治療藥物：IFN-α2b、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和IFN-α2a（PEGIFN）。這些藥物有利于抑制HBV復(fù)制，減輕肝臟損傷和減慢疾病進(jìn)展。此外抗病毒治療還可部分地糾正HBV特異性T淋巴細(xì)胞的低反應(yīng)性，但不能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的完全恢復(fù)［17］。對(duì)于A、B組類的HBV患者，如果及早的進(jìn)行了抗病毒治療來干預(yù)疾病的進(jìn)程，對(duì)控制肝纖維化的發(fā)展還應(yīng)是大有裨益的，對(duì)于不多見的B、D組類患者，應(yīng)如何改進(jìn)治療方案，也為臨床診治提出了問題。目前，關(guān)于乙肝的免疫治療已有大量研究，如體外擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞（DC）并經(jīng)HBsAg負(fù)載后自體回輸治療乙肝有一定治療效果，還有通過HBV治療性蛋白疫苗治療乙肝也起到一定療效［18，19］。近年來，免疫重建（immune reconstitution）方法逐漸興起［20］。免疫重建是指機(jī)體在較長(zhǎng)時(shí)期的免疫抑制后，主動(dòng)或被動(dòng)受多種因素影響下逐漸解除免疫抑制，免疫功能得到恢復(fù)或重建，可以是完全重建，也可以是不完全重建，包括表型和功能重建。

綜上，通過對(duì)HBV患者病毒復(fù)制狀況、自身免疫情況及肝纖維化指標(biāo)的聯(lián)合監(jiān)測(cè)，綜合評(píng)價(jià)患者的疾病進(jìn)程，以有效地選擇相應(yīng)的抗病毒藥物及免疫干預(yù)措施，對(duì)控制疾病的發(fā)展、改善病患的生活質(zhì)量等方面是很有價(jià)值的。

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The relativity study of HBV DNA、AMA and hepatic fibrosis for patients of hepatitisB

JINJian-guo，MAZuo-xin.（DepartmentofLaboratoryMedicine，TraditionalChineseMedicalHospitalofFushun，F(xiàn)ushun113008，China）

ObjectiveTo study relativity and clinical value about HBV DNA、anti-mitochondrion antibody（AMA）and hepatic fibrosis.MethodsPolymerase chain Reaction techonology is used to detect HBV DNA.Determination of LN，HA，PCⅢ and CIV is tested by chemical luminous assay.Using indirect immune fluorescent assay and immune printing assay examine AMA and its M2subtype antibody respectively.ResultsAfter comparing the results of hepatic fibrosis about every group，the following cases are analysed：the comparison between A group（Its concentration of HBV-DNA is between 1E＋3copies／ml and 1E＋5copies／ml）and B group（Its concencration of HBV-DNA is above 1E＋5copies／ml）has significant difference（P＜0.01），the comparison between B group and D group（Its concentration of HBV DNA is above 1E＋5copies／ml and Its AMA is positive）has significant difference（P＜0.01），and the comparison between each group and healthy group also has significant difference（P＜0.01），in addition ，there is no signifiant difference between group A and B（P＞0.05）.Conclusion1.The determination of LN，HA，PCⅢand CIV could reflect the process of hepatic fibrosis and direct the clinical treatment.2.It is more possible to develop hepatic fibrosis in patients who have active copoying of HBV DNA and AMA positive than that of single HBV DNA positive.

HBV DNA；AMA；hepatic fibrosis

R512.6＋2

A

1007－4287（2012）02－0278－04

2011－01－14）