楊 蓉，許冠群，王學(xué)鋒，丁秋蘭，吳 方

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 老年科，上海 200025）

vWD2N型診斷試驗(yàn)的新探索

楊 蓉，許冠群，王學(xué)鋒，丁秋蘭，吳 方＊

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 老年科，上海 200025）

目的 血管性血友?。╲on Willebrand disease，vWD）分3型，各型具有不同的病理生理機(jī)制、臨床特點(diǎn)、治療方法，為了更好的治療，需要明確其分型。vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)（vWF：FⅧ）可作為vWD2N型的確診實(shí)驗(yàn)之一。方法對20例vWD患者進(jìn)行改良的vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)，及各種vWD分型實(shí)驗(yàn)，對結(jié)合試驗(yàn)診斷為vWD2N型患者的血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）所有外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行基因序列分析，以此評價(jià)改良的結(jié)合實(shí)驗(yàn)對vWD2N型診斷的準(zhǔn)確性。結(jié)果對20例vWD患者進(jìn)行改良的vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果為FⅧ結(jié)合正常者10例，F(xiàn)Ⅷ結(jié)合減少者8例，F(xiàn)Ⅷ結(jié)合缺失者2例。對FⅧ結(jié)合缺失2例患者進(jìn)行的vWF 52個(gè)外顯子基因及其側(cè)翼序列進(jìn)行檢測，分別發(fā)現(xiàn)基因突變E15 72648-72653insCCGTG雜合、E25 106026C＞T（T1122M）雜合，故這兩例患者可確診為vWD2N型。結(jié)論本文中所建立的改良的vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)可以較好的確診vWD2N型。

血管性血友??；血管性血友病2N型；vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)；血管性血友病因子；基因檢測

（ChinJLabDiagn，2012，16：0265）

血管性血友?。╲on Willebrand disease，vWD）2N型是vWD的一個(gè)亞型，是由于血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）與FⅧ的結(jié)合位點(diǎn)突變引起vWF與FⅧ結(jié)合障礙，使得FⅧ快速降解而導(dǎo)致的一種出血性疾病。vWD各型、各亞型間具有不同的生理病理機(jī)制，其臨床特征與治療方法也各不相同。vWD2N型診斷依賴于vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)（vWF：FⅧ），而國內(nèi)尚無標(biāo)準(zhǔn)化的vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)方法。本文擬建立了改良的vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)，并對20例vWD患者進(jìn)行vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)檢測，同時(shí)對該方法診斷的vWD2N型患者進(jìn)行基因診斷，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 研究對象2008年9月-2009年5月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院血管性血友病患者20例，均按ISTH制定的vWD診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷，其中vWD 2N型主要依據(jù)本文建立的方法診斷。FⅧ活性（FⅧ：C）、vWF抗原（vWF：Ag）、瑞士托霉素輔因子活性測定（vWF：ROC）、瑞士托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集（RIPA）及vWF膠原結(jié)合試驗(yàn)（vWF：CB）參見參考文獻(xiàn)［1］。

1.2 vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)方法建立

1.2.1 vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)（vWF：FⅧ）原理 本實(shí)驗(yàn)基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的原理，在體外檢測vWF與FⅧ結(jié)合能力。vWF與重組的FⅧ結(jié)合，以排除自身FⅧ濃度對兩者的結(jié)合情況的影響。

1.2.2 vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)（vWF：FⅧ）方法 （1）試劑：ELISA板、包被抗體、重組FⅧ、牛血清白蛋白（BSA）、NaCL、Tris-Base、正常人血漿、顯色工具、Tween 20、CaCL2、包被buffer、20%乙酸。（2）儀器：37℃恒溫孵育箱、ELISA板計(jì)數(shù)器和清洗器、吸管、絕緣容器、酶標(biāo)儀。（3）步驟：包被ELISA板→配置緩沖液→加樣→去除內(nèi)源性FⅧ，加入重組FⅧ→FⅧ發(fā)射底物顯色→將ELISA板放入酶標(biāo)儀，在405nm處讀數(shù)→將同一份樣本不通稀釋度所得吸光度結(jié)果作圖，進(jìn)行待測樣本與正常人、陽性對照結(jié)果的比對。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)果分為FⅧ結(jié)合正常、減少、缺失三種類型，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：結(jié)合率≧1為FⅧ結(jié)合正常，0.1＜結(jié)合率＜1為FⅧ結(jié)合減少，結(jié)合率≦0.1為FⅧ結(jié)合缺失。

1.3 對疑似vWD2N型患者的vWF 52個(gè)外顯子基因進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 正常人vWF FⅧ結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，其結(jié)合率大于1，多次重復(fù)測定，其結(jié)合率為1.4143±0.2549，95% 可 信 區(qū) 間 為 （1.0977，1.7309）。

2.1.2 陽性對照vWF FⅧ結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，其結(jié)合率小于0.1，多次重復(fù)測定，其斜率為0.0606±0.016，95%可信區(qū)間為（0.0203，0.0965）。

圖2 陽性對照vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 患者vWF FⅧ結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果為FⅧ結(jié)合正常者10例，F(xiàn)Ⅷ結(jié)合減少者8例，F(xiàn)Ⅷ結(jié)合缺失者2例（見表1）。

表1 患者vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

2.2 根據(jù)vWD分型檢測試驗(yàn)及vWFFⅧ結(jié)果對入選的vWD患者進(jìn)行分型，結(jié)果如表2所示（略去與本研究無關(guān)的分型試驗(yàn)結(jié)果）。

2.3 基因檢測結(jié)果對疑似vWD2N型的2例患者進(jìn)行的vWF 52個(gè)外顯子基因進(jìn)行檢測，分別發(fā)現(xiàn) 基 因 突 變 E15 72648-72653insCCGTG、E25 106026C＞T（T1122M）（見表 3）。E15 72648-72653insCCGTG位于常見vWD2N型突變（E18-E28）的上游，其改變會(huì)影響到下游序列的表達(dá)，影響vWF與FⅧ結(jié)合。E25 106026C＞T（T1122M）位于D′-D3區(qū)即位于vWF與FⅧ結(jié)合區(qū)域，故我們可認(rèn)為兩例患者均為vWD2N型。

表2 患者一般情況

表3 基因檢測結(jié)果

3 討論

血管性血友病因子（Von Willebrand Factor，vWF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓巨核細(xì)胞合成的一種糖蛋白，存在于血漿與血小板中。vWF基因位于12號(hào)染色體，全長178kb，由52個(gè)外顯子和51個(gè)內(nèi)含子組成。vWF的正常生理功能包括：①通過與血小板糖蛋白（GP）Ⅰb和Ⅱb－Ⅲa結(jié)合，促使血小板聚集；還可以介導(dǎo)血小板黏附到損傷內(nèi)皮細(xì)胞暴露的膠原表面，這些效應(yīng)加速了血小板血栓的形成，在止血過程中起重要的作用。②作為FⅧ的載體，其與FⅧ結(jié)合后能使FⅧ在血漿中保持穩(wěn)定，在凝血中具有重要的作用［2，3］。

vWD2N型是血管性血友?。╲on Willebrand disease，vWD）的一種亞型。由于vWD2N型患者FⅧ難以和vWF結(jié)合，而被快速降解，其出血癥狀與血友病A（Heamophilia A，HA）相似，F(xiàn)Ⅷ：C下降，出血時(shí)間可正常，vWF：Ag和vWF：Act可正常。vWD2N型很容易被誤診為HA，為了鑒別vWD2N型與HA也很有必要進(jìn)行vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)測定vWF與外源性重組FⅧ的結(jié)合能力，主要用于區(qū)分vWD2N型與中、重度血友病A［4］。

Nishino等［5］于1989年提出了測定vWF：FⅧ的方法，其他一些學(xué)者［6，7］又陸續(xù)改良了vWF：FⅧ的測定方法。我們認(rèn)為vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)是一項(xiàng)優(yōu)先于突變分析的重要篩選試驗(yàn)，它不僅可以鑒別vWD2N型，也可以鑒別vWD2N型與vWD1型或vWD2型其它亞型突變的混合型［8，9］。本文所采取的是改良的vWF：FⅧ結(jié)合試驗(yàn)，其主要的特點(diǎn)是①將患者血漿對倍稀釋，這樣可以降低vWF：Ag對其與FⅧ結(jié)合的影響；②使用FⅧ發(fā)射底物試劑盒檢測，與酶標(biāo)法相比，可以提高反應(yīng)的靈敏性；③不需分別檢測vWF：Ag與結(jié)合FⅧ的量，只需一次檢測即可得到結(jié)果，操作更加簡便。我們的研究表明用正常人vWF：FⅧ為1.4143±0.2549，1.0000可以作為vWF：FⅧ的正常下限，與Caron等［7］的研究結(jié)果相似。在本研究中，vWD2N型vWF：FⅧ為0.0216±0.0183，vWD其它型vWF：FⅧ結(jié)合為0.3957±0.0914，vWD2N型患者與其它亞型血友病有著明顯的差別。而且我們對該方法診斷的疑似vWD2N型的2例患者的vWF基因檢測結(jié)果表明2例患者確為vWD2N型。因此，我們建議vWF：FⅧ＜0.1者都應(yīng)該進(jìn)行基因檢測，以明確是否為vWD2N型。

在本文和其它一些文章中，vWF：FⅧ不能單獨(dú)地解釋vWD2N型中FⅧ：C水平的變異，這時(shí)應(yīng)該考慮患者的血型。ABO血型可以影響vWF：Ag的水平，進(jìn)而影響FⅧ：C的高低。O型血的人往往比其它血型的人FⅧ：C水平低型［10］。因此，需要更進(jìn)一步的研究去評估攜帶vWD2N型突變個(gè)體中FⅧ：C水平與血型之間的關(guān)系。

我們的研究認(rèn)為vWF：FⅧ試驗(yàn)是一個(gè)精確的、敏感的和特異的試驗(yàn)，其結(jié)果不受vWF：Ag的影響，有助于vWD患者中區(qū)分出2N型，還可以幫助鑒別vWD2N型和HA患者。本試驗(yàn)排除了普通的出血、服用抗凝藥者，及狼瘡抗凝物質(zhì)的干擾，但是FⅧ和vWF抑制物的干擾需要進(jìn)一步的研究。

［1］謝飛，王鴻利，王學(xué)鋒.血管性血友病診斷與分型方法的建立［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 ，2006，29（9）：804.

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［5］Nishino M，Girma JP，Rothschild C，et al.New variant of von Willebrand disease with defective binding to factor VIII［J］.Blood，1989，74：1591.

［6］Casonato A，Pontara E，Zerbinati P，et al.The evaluation of factor VIII binding activity of von Willebrand factor by means of an ELISA：significance and practical implications［J］.Am J Clin Pathol，1998，109：347.

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The new diagnostic test of vWD2N

YANGRong，XUGuan-qun，WANGXue-feng，etal.（DepartmentofGeriatric andclinicalbloodtransfusion，RuijinHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine，Shanghai200025，China）

ObjectiveThe von Willebrand disease（vWD）is generally divided into three types，which has different physiopathologic mechanisms，clinical features，and treatment methods.For accurcte treatment，we need to identify their types.The vWF：FⅧbinding assay is one of the diagnosis test for vWD2N.MethodsThe improved vWF：FⅧbinding assay and vWD classification assays were preformed in twenty patients with vWD.The sequences of all the exons and exons-intron boundaries of the von Willebrand factor gene were amplified by PCR and by direct sequencing in the patients with vWD2Ndiagnosed by vWF：FⅧbinding assay.ResultsThe results of vWF：FⅧbinding assay showed that vWF：FⅧ binding assay was normal in ten patients reduced in eight patients，deleted in two patients.The gene mutations of E15 72648-72653insCCGTG、E25 106026C＞T（T1122M）were identified by the genetic testing of 52exon of vWF in the two patients who are suspected of vWD2N.The results displays that they are truely the type of vWD2N.ConclusionThe improved the vWF：FⅧbinding assay may be a better method to diagnose the vWD2N.

von Willebrand disease；von Willebrand disease 2N；vWF：FⅧbinding assay；von Willebrand Factor；genetic testing

R554＋.1

A

1007－4287（2012）02－0265－04

＊通訊作者

2011－09－21）