姜 洋，田小川，崔春國，王凌燕，朱 平

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院a.結(jié)直腸外科；b.乳腺外科；c.心血管內(nèi)科，吉林 長春 130033；2.解放軍軍事醫(yī)學科學院11所）

LHRH-PE40誘導分化胃癌細胞凋亡的研究

姜 洋1a，田小川1a，崔春國1b，王凌燕1c＊，朱 平2

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院a.結(jié)直腸外科；b.乳腺外科；c.心血管內(nèi)科，吉林 長春 130033；2.解放軍軍事醫(yī)學科學院11所）

目的 研究 NF-κB mRNA和Caspase-3mRNA及其蛋白在誘導分化BGC-823細胞中的表達，探討LHRH-PE40與胃癌細胞凋亡的關(guān)系。方法應用RT-PCR、Western blot法檢測BGC-823細胞中NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA表達及其蛋白的表達情況。結(jié)果LHRH-PE40誘導BGC-823細胞凋亡時，NF-κB mRNA和Caspase-3mRNA表達水平有所增加，NF-κB P65和Caspase-3P20活性片段也增加。結(jié)論LHRH-PE40可以誘導胃癌細胞內(nèi)NF-κB的活化；引起Caspase-3級聯(lián)反應，促進細胞凋亡。

LHRH-PE40；胃癌，細胞凋亡

（ChinJLabDiagn，2012，16：0221）

LHRH-PE40作為毒性部分的綠膿桿菌外毒素A（PE40）進入細胞質(zhì)，通過抑制蛋白質(zhì)合成殺傷靶細胞［1，2］。由實驗證實，LHRH-PE40作為一種免疫毒素不但殺傷細胞，同時能夠促進細胞凋亡。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）在細胞凋亡中起著重要作用；Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，在各種細胞中均有表達。本研究應用RT-PCR、Western blot法，研究 NF-κB mRNA 和 Caspase-3mRNA 及其蛋白在LHRH-PE40誘導分化BGC-823細胞中的表達，旨在探討NF-κB和Caspase-3與胃癌細胞凋亡的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 BGC-823細胞的收集及裂解

BGC-823細胞株，由長春基因工程藥物研究所提供。① 棄培養(yǎng)液，洗細胞。② 每孔加入1ml PBS，用細胞刮將細胞刮下轉(zhuǎn)移至離心管中離心。③ 向離心管中加入細胞裂解液煮沸，離心。

1.2 實驗分組

實驗對象分2組：正常BGC-823細胞組；0.2 μg／ml LHRH-PE40誘導BGC-823細胞48h組。

1.3 蛋白質(zhì)含量的測定—免疫印跡法（Western blot）

①提取蛋白質(zhì)樣品，沉淀，冷卻，離心后取上清。②轉(zhuǎn)膜。③洗滌，漂洗，夾濾紙中，待照相記錄，分析結(jié)果。

1.4 目的基因mRNA的表達

利用Trizol法將BGC-823細胞提取總RNA后，測定RNA純度及含量，A260／A280約在1.8－2.0之間，基本無蛋白質(zhì)污染。RNA經(jīng)電泳后，可見28SRNA：18SRNA約為2∶1。mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，擴增β-actin基因。將其電泳，觀察、攝片。測定各組 NF-κB P65和 Caspase-3mRNA RT-PCR產(chǎn) 物 灰 度 與 內(nèi) 參 照 β-actin mRNA RTPCR產(chǎn)物灰度的比值。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA的表達

在兩組BGC-823細胞中均有 NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA表達，其平均相對表達水平見表1，RT-PCR 電泳結(jié)果見圖1、2。0.2μg／ml LHRH-PE40 干 預 組 BGC-823 細 胞 NF-κB P65 mRNA、Caspase-3mRNA相對表達水平明顯升高，與正常對照組比較，有顯著差異（P＜0.001，P＜0.01），說 明 LHRH-PE40 能 引 起 BGC-823 細 胞NF-κB P65mRNA、Caspase-3mRNA表達上調(diào)，促進細胞凋亡。

表1 每組 NF-κB mRNA、Caspase-3mRNA的表達量（±s，n＝6）

表1 每組 NF-κB mRNA、Caspase-3mRNA的表達量（±s，n＝6）

P＜0.01，vs Control

Group NF-κB P65／β-actin Caspase-3／β-actin Control 0.39±0.03 0.92±0.47 LHRH-PE40 0.81±0.07＊ 1.78±0.36＊

圖1 每組NF-κB mRNA的表達量

圖2 每組Caspase-3mRNA的表達量

2.2 NF-κB P65、Caspase-3P20的表達

在2組 BGC-823細胞中均可見 NF-κB P65、Caspase-3P20表達，見圖3、4。0.2μg／ml LHRHPE40干預組 BGC-823細胞 NF-κB P65、Caspase-3 P20活性片段條帶與正常對照組相比，有明顯增粗，說 明 LHRH-PE40 能 引 起 BGC-823 細 胞 NF-κB P65、Caspase-3P20活性片段增加，促進細胞凋亡。

圖3 每組NF-κB P65的表達量

圖4 每組Caspase-3P20的表達量

3 討論

LHRH-PE40細胞毒性部分為PE40，將PE分子的Ⅰa去除，就形成了PE40。毒素一旦進入細胞質(zhì)，通過滅活28srRNA，阻止延長因子-2和60s核糖體亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成［3］。通過實驗證實，LHRH-PE40對腫瘤細胞進行殺傷的同時，又會促進細胞凋亡。

NF-κB如同第二信使可以傳遞上游信號，從應激觸發(fā)、信號作用于細胞膜受體到NF-κB活化進入細胞核內(nèi)的過程是一個相互調(diào)節(jié)、相互影響的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。有學者認為NF-κB是一種促凋亡因子，NF-κB的激活可以促進某些細胞系的凋亡［5］；也有學者認為NF-κB可以通過誘導細胞表達TNF受體結(jié)合分子（TRAF1、TRAF2）和凋亡抑制蛋白（IAP），抑制Caspases的級聯(lián)反應，進而阻斷TNF受體／Fas介導的調(diào)亡信號的轉(zhuǎn)導，來抑制細胞凋亡的發(fā)生［4］。本研究結(jié)果顯示：0.2μg／ml LHRHPE40能使NF-κB P65mRNA及其蛋白表達明顯增加，該濃度下，BGC-823細胞凋亡指數(shù)較高。

Caspase-3是各種細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必經(jīng)之路，是凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，同時也是許多細胞凋亡的重要效應蛋白，故又稱之為“死亡蛋白”［6］。發(fā)生的凋亡作用主要表現(xiàn)為：①直接破壞細胞結(jié)構(gòu)；②滅活凋亡抑制因子；③調(diào)節(jié)酶蛋白、裂解其效應功能區(qū)域［7］。本實驗發(fā)現(xiàn)通過激活NF-κB，進一步活化Caspase-3途徑誘導誘導BGC-823細胞凋亡。

本研究對能促進凋亡產(chǎn)生的關(guān)鍵酶Caspase-3 mRNA及其蛋白進行檢測，結(jié)果顯示：LHRH-PE40誘 導 BGC-823 細 胞 凋 亡 時，NF-κB mRNA 和Caspase-3mRNA 表 達 水 平 有 所 增 加，NF-κB P65和Caspase-3P20活性片段也增加。因此，本研究認為，LHRH-PE40作用BGC-823細胞，可以產(chǎn)生作為凋亡應激原的細胞因子而啟動凋亡程序，使NF-κB P65活化，最終會通過 Caspase-3途徑而引起細胞凋亡；同時本研究也認為，通過NF-κB使Caspase-3激活只是LHRH-PE40介導胃癌細胞凋亡的一條重要途徑，但可能不是唯一的，LHRHPE40介導胃癌細胞凋亡還可能通過不依賴Caspase-3的其他途徑進行。

［1］Endo Y，Mitsui K，Motizuki M，et al.The mechanism of action of ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes.The site and the characteristics of the modification in 28Sribosomal RNA caused by the toxins［J］.J Biol Chem，1987，262（12）：5908.

［2］Szepeshazi K，Schally AV，Halmos G.LH-RH receptors in human colorectal cancers：unexpected molecular targets for experimental therapy［J］.Int J Oncol，2007，30（6）：1485.

［3］Dunn RD，Weston KM，Longhurst TJ，et al.Antigen binding and cytotoxic properties of a recombinant immunotoxin incorporating the lytic peptide，melittin ［J］.Im munotechnology，1996，2（3）：229.

［4］Baichwal VR，Baeuerle PA.Activate NF-kappa B or die［J］.Curr Biol，1997，7（2）：R94.

［5］Wang CY，Mayo MW，Korneluk RG，et al.NF-kappa B antiapoptosis：induction of TRAF1and TRAF2and c-IAP1and c-IAP2to suppress caspase-8activation ［J］.Science，1998，281（5383）：1680.

［6］Bonavia R，Bajetto A，Barbero S，et al.HIV-1Tat cause apoptotic death and calcium homeostasis alteration in rat neurons［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，288（2）：301.

［7］彭黎明，王曾禮.細胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：83－84.

LHRH-PE40differentiation stomach cancer cell apoptosis of research

JIANGYang，TIANXiao-chuan，CUIChunguo，etal.（China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033，China）

ObjectiveStudy the NF-κB mRNA and Caspase-3mRNA and protein in the differentiation BGC-823 cells，is to explore the expression LHRH-PE40and gastric cancer cell apoptosis relationship.MethodsApplication RTPCR，blot method to detect that BGC-823cells in the NF-κB mRNA，Caspase-3mRNA expression and its protein expression.ResultsLHRH-PE40induction BGC-823cell apoptosis，the NF-κB mRNA and Caspase-3mRNA expression level increases，the nf-kappa B P65and Caspase activity-3pieces also increases.ConclusionLHRH-PE40can induce gastric cancer cells the nf-kappa B activation；Cause Caspase-3cascade，promote cell apoptosis

LHRH-PE40；Apoptosis；Stomach cancer

R735.2

A

1007－4287（2012）02－0221－03

＊通訊作者

2010－12－19）