鄭 斌，王 欣，麻彤輝＊

（1.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130041）

胡椒堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞抗腫瘤活性的體外實(shí)驗(yàn)研究

鄭 斌1，王 欣2，麻彤輝2＊

（1.吉林大學(xué) 白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130041）

目的 探討胡椒堿（piperine）對(duì)人HpeG2肝癌細(xì)胞株的增殖、殺傷和細(xì)胞凋亡的影響，為肝癌的治療提供理論依據(jù)。方法體外培養(yǎng)的HpeG2細(xì)胞，采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度胡椒堿對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞和新分離的外周血白細(xì)胞的增殖抑制作用。Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡。結(jié)果胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率隨著濃度的升高而增加，半量抑制濃度（IC50）為15.13±3.21μmol／L，低于其對(duì)外周血白細(xì)胞的抑制率（64.52±5.32μmol／L）。Hoechst 33258染色后，胡椒堿處理癌細(xì)胞組表現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)20μmol／L的胡椒堿處理HepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率由對(duì)照組的2.89%上升到了21.76%。結(jié)論胡椒堿具有抑制HepG2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的抗腫瘤活性，有應(yīng)用于肝癌治療的潛在價(jià)值。

胡椒堿；肝癌；HepG2；細(xì)胞凋亡

（ChinJLabDiagn，2012，16：0218）

Pradeep CR等人［1研究發(fā)現(xiàn)胡椒堿可抑制B16F-10黑色素瘤誘導(dǎo)的肺轉(zhuǎn)移，明顯減少腫瘤的形成，延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活期。這說(shuō)明胡椒堿有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。但是未見(jiàn)胡椒堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的報(bào)道，本文報(bào)道胡椒堿在體外對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株生長(zhǎng)及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑胡椒堿（中國(guó)藥品生物制品檢定所），1640培養(yǎng)基（sigma），DMED 培養(yǎng)基（sigma），四甲基偶氮唑鹽（MTT試劑盒）（羅氏診斷），胎牛血清（Hyclone），Hoechst 33258（sigma），細(xì)胞凋亡試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），人外周血白細(xì)胞分離液（天津TBD公司），細(xì)胞板（corning），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞株，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人外周血由志愿者提供，按公司說(shuō)明書(shū)分離外周血白細(xì)胞后，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT比色法測(cè)定胡椒堿對(duì)HepG2和白細(xì)胞的增殖抑制作用移除細(xì)胞培養(yǎng)液后，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，棄胰酶，加入10ml培養(yǎng)基，用移液器吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔5000細(xì)胞鋪滿96孔板，12h后移除培養(yǎng)基，加入含不同濃度胡椒堿（自200μmol／L以下倍比稀釋到1.56 μmol／L）的培養(yǎng)基100μl，另設(shè)空白孔（只含培養(yǎng)基）和對(duì)照孔（不加入胡椒堿）。細(xì)胞與藥物在37℃，5%CO2共孵育18h后，每孔加入10μl MTT溶液（10mg／ml），共孵育4h后，加入 MTT溶解液100μl，37℃孵育過(guò)夜后，在590nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度（A值）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率＝1－（實(shí)驗(yàn)孔－空白孔）／（對(duì)照孔－空白孔）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。測(cè)定胡椒堿對(duì)外周血白細(xì)胞的增殖抑制同上。

1.4 Hoechst 33258染色觀測(cè)細(xì)胞核形態(tài)細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)和藥物處理24h后，75%乙醇室溫固定15min，去除固定液，PBS洗三次，用10μg／ml Hoechst 33258溶液對(duì)正常細(xì)胞和胡椒堿處理的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核染色，避光孵育30min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)，并照相記錄。

1.5流式細(xì)胞儀測(cè)定胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡的影響上述細(xì)胞接種于12孔板中，每孔105個(gè)細(xì)胞，20μmol／L的胡椒堿處理24h后，0.25%胰蛋白酶消化，1000r／min離心5min收集細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，先后加入Annexin V-FITC避光染色5min，離心，重懸，加入PI染液避光染色10 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量資料均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞和外周血白細(xì)胞的增殖抑制作用不同濃度的胡椒堿處理HepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞增殖抑制隨著藥物濃度增加而升高，IC50為15.13±3.21μmol／L，劑量－抑制曲線如圖1，胡椒堿對(duì)外周血白細(xì)胞的增殖抑制作用也呈劑量依賴方式，其IC50為64.52±5.32 μmol／L大于其作用于肝癌細(xì)胞的IC50，表明胡椒堿對(duì)人外周血白細(xì)胞的毒性較HepG2細(xì)胞毒性小。劑量抑制曲線如圖2。

2.2Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化細(xì)胞經(jīng)處理，固定染色后，對(duì)照組的細(xì)胞核發(fā)均一的藍(lán)光，而胡椒堿處理的細(xì)胞，細(xì)胞核破壞，細(xì)胞核內(nèi)的DNA被酶裂解片段化，與其他細(xì)胞器一起組成凋亡小體，凋亡小體內(nèi)的DNA與Hoechst 33258結(jié)合，發(fā)出碎塊狀的濃密亮藍(lán)色。見(jiàn)圖3。

2.3胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響20μm胡椒堿處理引起HepG2細(xì)胞的凋亡率和死亡率都明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)圖4，結(jié)果表明，胡椒堿可誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

圖1 不同濃度胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖2 胡椒堿對(duì)白細(xì)胞活力的影響

圖3 細(xì)胞核形態(tài)對(duì)比分析（Hoechst 33258染色，A對(duì)照組，B為20μM胡椒堿處理24h，400×）

圖4 Annexin V-FITC／PI雙染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胡椒堿對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

原發(fā)性肝癌（簡(jiǎn)稱肝癌）是由肝細(xì)胞或者肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，在我國(guó)的惡性腫瘤發(fā)病中居第二位，全世界肝癌新發(fā)病人的45%分布于中國(guó)大陸。肝癌極具侵襲性，預(yù)后差。目前肝癌主要是手術(shù)干預(yù)（肝切除和肝移植）和局部射頻消融，這些方法只能對(duì)早期局部的小腫瘤療效好，而更晚期的腫瘤則很難治愈［2］。現(xiàn)行肝癌治療藥物以阿霉素和5－氟尿嘧啶等最為常用，但是這些藥物對(duì)患者的治療有效率低且無(wú)明顯延長(zhǎng)壽命效果，因此尋找和開(kāi)發(fā)新的特異性高療效好的抗腫瘤藥物成為肝癌治療的焦點(diǎn)。

胡椒堿是從胡椒科植物果實(shí)中提取的一種天然的次生代謝產(chǎn)物，是一種廣譜的抗癲癇藥物［3］，Parmar等曾報(bào)道其具有解熱、抗炎和降壓的功效［4］，王玉芳等曾報(bào)道胡椒堿對(duì)白紋伊蚊C6／36細(xì)胞系的毒性作用，但藥物誘導(dǎo)凋亡在細(xì)胞毒性作用中不占主導(dǎo)地位［5］，與本實(shí)驗(yàn)中流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)表明，胡椒堿對(duì)人外周血白細(xì)胞的毒性較小，能以劑量依賴的方式抑制肝癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。具有重要應(yīng)用價(jià)值。而Lakshmanan Vellaichamy等發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有保護(hù)DMBA誘導(dǎo)的瑞士白化病小鼠的皮膚癌發(fā)生的潛力［6］。K Selvendiran發(fā)現(xiàn)，在苯并芘誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生中，胡椒堿具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程和保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)合酶類的作用［7］。

綜上所述，胡椒堿具有重要的生物應(yīng)用價(jià)值，尤其是在癌癥的治療方面，但是其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

［1］Pradeep CR，Kuttan G.Effect of piperine on the inhibition of lung metastasis induced B 1 6F-10melanoma cells in mice［J］.Clinical and Experimental Metastasis，2002，19：703.

［2］Sukowati CHC.Hepatic cancer stem cells and drug resistance［J］.World Journal of Hepatology，2010，2（3）：114.

［3］裴印權(quán)，岳 微，崔景榮，等.胡椒堿衍生化物的中樞藥理作用研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1980，4（15）：198.

［4］Virinder SP，Subhash CJ，Kirpal SB，et al.Phytochemistry of the Genus Piper［J］.Phytochemisrry，1997，46（4）：591.

［5］王玉芳，諸葛洪祥，周 霞，等.胡椒堿對(duì)白紋伊蚊C6／36細(xì)胞株的毒性作用［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2007，50（5）：481.

［6］Lakshmanan V，Subramanian B，Kuppusamy P，et al.Chemopreventive potential of piperine in 7，12-dimethylbenz［a］anthracene induced skin carcinogenesis in Swiss albino mice［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2009，28：11.

［7］K.Selvendiran，D，Sakthisekaran.Chemopreventive effect of piperine on modulating lipid peroxidation and membrane bound enzymes in benzo（a）pyrene induced lung carcinogenesis［J］.Biomedicine ＆ Pharmacotherapy，2004，58：264.

Inhibitory effect of piperine on human HepG2hepatocarcinoma cell in vitro

ZHENGBin，WANGXin，MATong-hui.（JilinUniversity，BethuneMedicalSchool，Changchun130021，China）

ObjectiveTo study the inhibitory effect of piperine on HepG2cell in vitro.MethodsThe human hepatocarcinoma HepG2cells were cultured in vitro and divided into control group and piperine-treated group.MTT assay was performed to evaluate the proliferation inhibitory effects of piperine on HepG2cells and freshly prepared peripheral white blood cells.Hoechst 33258nuclear staining was performed to detect the mode of cell death.Flow cytometry was used to assess the effects of piperine treatment on cell apoptosis in human HepG2cells.ResultsThe inhibitory effect of piperine treatment on HepG2cell proliferation increases with the dose，and the half inhibition concentration（IC50）was 15.13±3.21μmol／L，which was lower than that for peripheral white blood cell（IC50＝64.52±5.32μmol／L）.Piperine treated HepG2cells showed typical apoptotic characteristics.After treated with 20μmol／L piperine for 24h，the apoptosis rate increased from 2.89%of control group to 21.76%.ConclusionPiperine has cytotoxicity effect on cultured human HepG2cells in vitro，and can inhibit proliferation and induce apoptosis.

piperine；hepatocarcinoma；HepG2；apoptosis

R735.7

A

1007－4287（2012）02－0218－03

吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”（2010A71109）

＊通訊作者

2010－11－29）