王 雪，張馨木，崔常雷，韓樹海＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院）

rhKD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠自由基-抗自由基平衡以及凋亡中的保護作用

王 雪1，張馨木2，崔常雷1，韓樹海1＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院）

＊通訊作者

重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑（rhKD／APP）是通過基因工程方法獲得的具有廣譜絲氨酸蛋白酶抑制活性的新型蛋白酶抑制劑，吉林大學(xué)藥學(xué)院用畢赤酵母構(gòu)建了rhKD／APP表達體系，并通過擴增和純化手段獲得了高純度的具有天然結(jié)構(gòu)和活性的表達體系rhKD／APP［1］，為深入研究其器官保護機理及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。我研究小組已經(jīng)報導(dǎo)了rhKD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用［2］，本試驗通過觀察rhKD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性以及對凋亡指數(shù)的影響，據(jù)此從自由基清除以及抗凋亡角度闡明rhKD／APP的器官保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Wistar大鼠，雄性，250g－300g，購自吉林大學(xué)實驗動物部。

1.2 材料與主要試劑rhKD／APP由吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所生化室通過基因工程方法制備；依那普利（1.25mg／支），江蘇省常州制藥廠有限公司。

1.3 主要儀器TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機，長沙湘雅醫(yī)療器械廠；SYNCHRON CX3型生化分析儀，美國BECKMAN公司；電子分析天平AE100，Mettler-Toledo公司；HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)，日本；X-650型掃描電子顯微鏡，日本。

1.4 動物分組與處理取Wistar大鼠60只，隨機分為6組，每組10只。第1組為偽手術(shù)組。第2組為腎I／R模型組（模型組）：行大鼠雙腎腎蒂夾閉，暫時阻斷手術(shù)，制備腎臟缺血再灌注模型［3］。第3、4、5組分別為rhKD／APP小、中、大劑量組：腎I／R＋分別尾靜脈注射rhKD／APP 1、2、4萬 KIU·kg－1。第6組為依那普利組（對照組）：腎I／R＋尾靜脈注射依那普利0.134mg·kg－1。給藥途徑：第1－2組大鼠于造模前24h，模型建立后即刻，模型建立后24h尾靜脈注射生理鹽水，第3－5組大鼠于上述各時間點經(jīng)尾靜脈注射各個劑量的rhKD／APP，第6組（對照組）大鼠于上述各時間點經(jīng)尾靜脈注射依那普利。

1.5 檢測指標(biāo)及方法造模24h給藥后，從腹主動脈抽取3－4ml血液，靜置待血清析出后，以3 000r／min，離心10min，取上清液以美國BECKMAN—SYNCHRON CX3型全自動生化分析儀測定MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性。另取腎臟組織多聚甲醛液中固定，制備石蠟塊。TUNEL法測定細胞凋亡指數(shù)。計算方法為：凋亡指數(shù)＝陽性細胞數(shù)／視野所有細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS軟件包進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以xˉ±s表示，計量指標(biāo)兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組大鼠在腎缺血45min，再灌注48h后NO、MDA、SOD、GSH-PX活性見表1，與1組相比較，2組血清 NO、MDA含量顯著升高（P＜0.01），血清SOD、GSH-PX活性較顯著降低（P＜0.01），而4，5，6組大鼠血清 NO、MDA含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），SOD、GSH-PX活性顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；3組對血清 NO、MDA、SOD、GSH-PX含量影響無顯著性差異（P＞0.05）。5組對腎缺血再灌注損傷后大鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX含量的的影響優(yōu)于6組；4組對腎缺血再灌注后大鼠血清 NO、MDA、SOD、GSH-PX含量的影響與6組相近。

2.2 鏡下組織學(xué)檢查可見，假手術(shù)組大鼠腎小管上皮細胞疏散且界限較為不清，核著色淺藍，僅見少量TUNEL弱陽性反應(yīng)細胞。而模型組卻可見大量TUNEL陽性反應(yīng)細胞即凋亡細胞，胞體縮小，形狀不規(guī)則，胞核固縮濃染，呈深棕色，凋亡指數(shù)顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）。對照組有中等量TUNEL陽性細胞表達。rhKD／APP（小、中、大劑量）組TUNEL陽性反應(yīng)細胞均明顯減少，著色較淺，rh-KD／APP各劑量組凋亡指數(shù)，與模型組相比均顯著減少（P＜0.05），與對照組表現(xiàn)相近（見表2）。

表1 rhKD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX的影響（±s，n＝10）

表1 rhKD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX的影響（±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 NO（μmol／L） MDA（nmol／L） SOD（U／ml） GSH-PX（U／L）假手術(shù)組 35.63±8.45＊＊ 3.18±0.31＊＊ 14.57±0.32＊＊ 1105.76±194.48＊＊模型組 50.19±9.90 4.52±0.94 8.68±4.47 634.76±114.90小劑量組 47.65±7.40 4.38±0.69 12.0±3.36＊ 676.92±205.89中劑量組 40.80±8.87＊ 3.57±0.95＊ 12.58±2.38＊ 767.69±103.24＊大劑量組 37.78±12.21＊＊ 3.31±0.5＊＊ 13.32±2.43＊＊ 831.22±145.41＊＊對照組 42.61±7.36＊ 3.51±0.82＊ 11.97±2.0＊ 750.16±100.63＊

表2 rhKD／APP對大鼠腎缺血再灌注細胞凋亡的影響

3 討論

近年來大量研究證實，在導(dǎo)致腎缺血再灌注損傷的各種因素中，自由基連鎖反應(yīng)在其中扮演著重要的作用［4－7］。它可通過各種作用，如降低膜流動性、抑制酶的活性、破壞蛋白質(zhì)等，進一步引起線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙和細胞管架系統(tǒng)紊亂。除此之外，毛細血管內(nèi)皮細胞亦會受到過量自由基的攻擊?？梢姡捎谧杂苫淖饔?，可使腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞成片變性、壞死，引起腎小球濾過率下降從而發(fā)生腎功能衰竭。

隨著近來研究的不斷深入，人們逐漸意識到腎組織細胞也以凋亡的方式參與了腎缺血再灌注損傷的過程。研究發(fā)現(xiàn)：腎缺血再灌注時，細胞凋亡主要表現(xiàn)為皮髓交界處的腎小管發(fā)生凋亡，以再灌注12 h凋亡水平最高，可持續(xù)至少72h。凋亡的上皮細胞隨著腎小管上皮的再生而進入管腔排出，吞噬細胞在此過程中未發(fā)揮作用［8］。目前，對于腎缺血再灌注后細胞凋亡的機制尚無明確報道，但可以確定腎缺血再灌注后腎小管上皮細胞死亡的重要原因之一為腎小管上皮細胞的主動凋亡。其調(diào)節(jié)受到鈣超載、氧自由基、線粒體等許多內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，且與凋亡基因的表達密切相關(guān)，體外給予絲氨酸蛋白酶抑制劑rhKD／APP，可能通過抑制絲氨酸蛋白酶活性，從而拮抗依賴絲氨酸蛋白酶的幾個生理病理過程，包括絲氨酸蛋白酶依賴的NF-kB炎癥轉(zhuǎn)錄途徑，絲氨酸蛋白酶依賴的次黃嘌呤脫氫酶誘導(dǎo)的自由基損傷，以及拮抗鈣超載和細胞膜損傷，維持NF-kB凋亡抑制信號等使細胞免于凋亡。

本研究結(jié)果顯示：在腎缺血再灌注損傷后，與傳統(tǒng)的腎保護藥物依那普利相比，中劑量rhKD／APP組在調(diào)節(jié)大鼠血清 MDA、NO含量及上調(diào)SOD、GSH-PX活性的作用與依那普利相當(dāng)，但增加rh-KD／APP至大劑量后，其調(diào)節(jié)作用優(yōu)于依那普利。因此可證實大鼠腎缺血再灌注損傷時清除自由基的作用源于rhKD／APP。據(jù)此可以認(rèn)為rhKD／APP可通過清除自由基的途徑保護腎臟。rhKD／APP各劑量組的凋亡指數(shù)均顯著少于模型組（P＜0.05），提示延遲腎細胞凋亡為rhKD／APP在缺血再灌注損傷過程中保護腎臟的途徑之一。腎缺血再灌注為復(fù)雜的病理生理過程，本研究證實rhKD／APP可能通過促進自由基清除及延遲腎組織細胞的凋亡對腎缺血再灌注損傷起到器官保護作用，目前尚無rh-KD／APP對再灌注損傷大鼠保護作用的其他方面機制的研究，其進一步深入的研究必將對腎缺血再灌注損傷的保護有所裨益。

［1］賀巾超，楊莉莉，馬 杰，等.rhKD／APP大規(guī)模發(fā)酵及純化工藝研究［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2006，32（2）：278.

［2］韓樹海，崔常雷，張馨木，等.rhKD／APP對腎臟缺血在灌注損傷大鼠的腎保護作用［J］.中國實驗診斷學(xué)，2008，12（9）：1105.

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1007－4287（2012）02－0214－02

2011－05－16）