谷思洋，鄧立菊，姜宏宇

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 干部病房，吉林，長(zhǎng)春 130021；2.大慶龍南醫(yī)院，黑龍江，大慶 163453）

鈣拮抗劑硝苯吡啶對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用

谷思洋1，2，鄧立菊2，姜宏宇1＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 干部病房，吉林，長(zhǎng)春 130021；2.大慶龍南醫(yī)院，黑龍江，大慶 163453）

目的 研究鈣拮抗劑（Calcium antagonists）硝苯吡啶（Nifedipine）對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用。方法30只體重在260-300g的 Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、模型組、Nifedipine組（1μmmol／L）。大鼠麻醉后取出心臟，懸掛于Langendorff灌流裝置上行主動(dòng)脈逆行灌流，制備大鼠離體心臟缺血30min、再灌注120min模型；對(duì)照組行150min正常灌流。測(cè)定心肌梗死面積，檢測(cè)SOD（Superoxidedismutas超氧化物歧化酶）及 MDA（malonaldehyde丙二醛）的含量，免疫組化方法行PKCδ（The protein kinase C蛋白激酶C）的測(cè)定，用RT-PCR法測(cè)定NCX（Na＋／Ca2＋exchanger鈉鈣交換體）及SERCA2α（Sareoplasmie reticulum calcium adenodine triphosphatase肌漿網(wǎng)鈣泵）的表達(dá)。結(jié)果硝苯吡啶組心肌梗死面積較模型組明顯縮?。≒＜0.01）；冠脈灌流液中SOD活性明顯升高（P＜0.01）；MDA含量顯著下降（P＜0.01）；藥物組的PKC含量水平較模型組增多（P＜0.05），藥物組 NCX mRNA的表達(dá)水平較模型組降低，存在顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論鈣拮抗劑Nifedipine對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

硝苯吡啶（Nifedipine）；缺血／再灌注；心肌梗死；鈉鈣交換體（NCX）

（ChinJLabDiagn，2012，16：0210）

本研究采用大鼠離體心肌缺血／再灌注模型，觀察Nifedipine對(duì)缺血／再灌注心肌損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與儀器

體重在260-300g的wistar雄性大鼠（吉大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK—吉2007-0003）；Langendorff灌流裝置（成都泰盟科技有限公司）；分光光度計(jì)（上海尤尼柯有限公司）；BI-2000圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；OLYMPUS顯微鏡。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 硝苯吡啶（Nifedipine），購(gòu)自瑞士 Enzo life sciences公司。溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成1mmol／L貯備液，分裝成300μl小瓶，4℃冰箱中保存，應(yīng)用前取出37℃水浴中融化。用KH液稀釋成1μmol／L濃度。

1.2.2 KH 工作液 NaCl 6.92g，NaHCO32.1g，KC1 0.35g，CaC120.2g，MgSO40.14g，KH2PO40.16g，葡萄糖2.0g，加去離子水1000ml，在磁力攪拌機(jī)上充分?jǐn)嚢枞芙猓芙夂髮H調(diào)整為 （7.4±0.5）。

1.2.3 TTC染液 將0.5g TTC粉末加入裝有50 ml 1×PBS液的棕色瓶中，37℃水浴箱中15min，振蕩，制成TTC溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。SOD、MDA試劑盒由南京建成生物公司提供。PKCδ抗體由美國(guó)SAB signalway antibody生物工司提供。Trizol、DEPC、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶（寶生物工程大連有限公司）；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 離體大鼠心臟Langendorff灌流模型制備

測(cè)大鼠體重，以0.4g／kg水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹腔內(nèi)注入5mg／kg肝素鈉，開胸，迅速摘出心臟置于預(yù)先用95%O2＋5%CO2混合氣體（1.5L／min）所飽和的4℃KH液中。經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管懸掛于Langendorff灌流裝置上，調(diào)整懸掛位置使左、右冠脈分別得到充分的灌流，保持自搏心率，在10 kPa恒壓、37℃恒溫下以1.5L／min 95%O2＋5%CO2流量通氣，充分氧合的KH液按10ml／min灌流，剪去左心耳，將充水導(dǎo)管球囊插入左心室，向球囊內(nèi)注水約0.2－0.4ml，將左心室舒張壓調(diào)至1.1 kPa以上，記錄灌流壓、左心室壓力（美國(guó)MP150多導(dǎo)電生理記錄儀）及灌流量，穩(wěn)定后15min后開始心肌缺血再灌注模型的制備。

1.3.2 大鼠心臟缺血／再灌注的模型制備 選擇30 min的不完全缺血（即將左、右冠脈灌流量減到原灌流量的5%）及2h再灌注（10ml／min的KH液）。

1.3.3 試劑稀釋及實(shí)驗(yàn)分組 將預(yù)先分裝的硝苯吡啶，用KH液釋成1μmol／L濃度。將30只大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。組一：對(duì)照組；組二：為模型組；組三：在缺血時(shí)向主動(dòng)脈內(nèi)注入1μmol／L鈣拮抗劑硝苯吡啶（硝苯吡啶組）。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 SOD、MDA及心肌梗死面積檢測(cè) 收集灌流結(jié)束前1min的冠脈流液，根據(jù)試劑盒測(cè)量SOD、MDA的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取下心臟放入-20℃冰箱中冷凍1h，然后將心臟以心尖為起點(diǎn)切成1mm間隔橫斷切片，放入37℃氯化三苯基四氮唑（TTC）中染色30min，再置于4%多聚甲醛液中24h，于吉林大學(xué)設(shè)備處進(jìn)行實(shí)體圖像采集，梗死區(qū)（TTC未染色的白色區(qū)）和非梗死區(qū) （TTC染成紅色區(qū)），然后用BI-2000圖像分析系統(tǒng)計(jì)算心肌梗死面積（即梗死面積占全心面積的百分比）。

1.4.2 心肌PKCδ表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色法：取心肌標(biāo)本4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做成5μm切片，行HE染色。SP法行PKCδ免疫組織化學(xué)染色。切片常規(guī)脫蠟至水，置入3%H2O2孵育15 min，以封阻內(nèi)源性過氧化物酶。PBS浸泡3min×2次；用0.01M檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)自然冷卻后取出，PBS沖洗3min×2次。滴加山羊血清封阻，室溫下孵育10min。滴加PKCδ一抗（1∶100稀釋）37℃濕盒中孵育75min。PBS沖洗3min×3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗，濕盒中37℃孵育20 min。PBS沖洗3min×3次。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素，37℃孵育15min。PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色1min，自來水沖洗10min，蘇木精復(fù)染1min，自來水沖洗10min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在陰性對(duì)照切片中，滴加PBS替代PKCδ單克隆抗體，其余步驟不變。心肌PKCδ表達(dá)鑒定：細(xì)胞呈棕黃色染色者為陽(yáng)性細(xì)胞，利用BI-2000圖像分析軟件分析組化圖片平均光密度值。

1.4.3 NCX與SERCA 2α的 mRNA表達(dá) NCX與SERCA2α行RT-PCR：用Trizol抽提總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。取4μg總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA文庫(kù)。1μl模板用于目的基因的PCR擴(kuò)增。引物順序?yàn)镾ERCA2a，上 游 引 物：5′-ATGAGATCACAGCTATG ACTGGTG-3′，下 游 引物：5′-GCATTGCACATCTCTATGGTGACTAG-3′，產(chǎn)物：620bp；NCX，上游引物：5′-AATGAGCTTGGTGGCTTCACA-3′，下 游 引 物：5′-CCGCCGATACAGCAGCAC-3′，產(chǎn)物：861bp；GAPDH（內(nèi) 參 照 ），上 游 引 物：5′-GCCATCAACGACCCCTTCATTG-3′，下 游 引 物：5′-TGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3′，產(chǎn)物：597bp。反應(yīng)條件為SERCA2a：94℃ 5min，94℃ 3min，56℃30s，72℃30s，35次循環(huán)，72℃ 10min；NCX：94℃ 5 min，94℃3min，53℃30s，72℃30s，35次循環(huán)，72℃10min；G APDH：94℃5min，94℃3min，56℃30s，72℃30s，35次循環(huán)，72℃10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，用靶基因／GAPDH表示靶基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SOD及MDA的影響大鼠離體心臟經(jīng)過15 min平衡灌注，30min不完全缺血及2h再灌住，冠脈灌流液中，硝苯吡啶同模型組比較，SOD活性明顯升高（P＜0.01），MDA 含量顯著下降（P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠離體心臟冠脈流液中SOD、MDA含量比較（±s，n＝10）

表1 大鼠離體心臟冠脈流液中SOD、MDA含量比較（±s，n＝10）

注：與模型組比較，★P＜0.01

組別 SOD（U／ml） MDA（nmol／ml）4.432±2.068 0.703±0.142硝苯吡啶組 5.876±3.047★ 0.517±0.088模型組★

2.2 對(duì)大鼠離體心臟心肌梗死面積的影響對(duì)照組無心肌梗死出現(xiàn)；硝苯吡啶組梗死面積較模型組明顯減小，與模型組比較差異有顯著性（P＜0.01）。見表2。

2.3 HE染色與PKCδ表達(dá)結(jié)果心肌組織HE染色后400倍光鏡下見：對(duì)照組：心肌細(xì)胞排列規(guī)則，無間質(zhì)水腫；模型組：心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫，肌纖維腫脹，排列無序，橫紋消失，肌漿內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，可見較多粒細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)，并可見少量紅細(xì)胞滲漏，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)溶解、壞死；藥物組：心肌細(xì)胞輕度水腫，界限清楚，細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則，間質(zhì)無水腫，可見少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，無紅細(xì)胞滲漏。通過對(duì)心肌組織PKC平均光密度的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的PKC表達(dá)水平較低，缺血再灌注組PKC表達(dá)較對(duì)照組增多，且主要分布于胞漿中；硝苯吡啶組PKC水平較缺血再灌注組藥物組均能使PKC含量增加（P＜0.01），并能使心肌細(xì)胞的PKC從細(xì)胞核或細(xì)胞漿移位到細(xì)胞膜上，分布發(fā)生改變。見表3。

表2 各實(shí)驗(yàn)組在缺血再灌注損傷中的心肌梗死面積比較（±s，n＝10）

表2 各實(shí)驗(yàn)組在缺血再灌注損傷中的心肌梗死面積比較（±s，n＝10）

注：與模型組比較，★P＜0.01

組別 梗死面積（%）對(duì)照組 無模型組 31.6±0.081硝苯吡啶組 21.6±0.091★

表3 心肌組織免疫組化PKC表達(dá)平均光密度的比較（±s，n＝10）

表3 心肌組織免疫組化PKC表達(dá)平均光密度的比較（±s，n＝10）

注：與正常組比較，●P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.01

組別 n 10 0.237±0.018模型組 10 0.296±0.011●硝苯吡啶組 10 0.321±0.014平均光密度對(duì)照組★

2.4 NCX及SERCA2αmRNA表達(dá)擴(kuò)增條帶清晰明亮，與預(yù)先設(shè)計(jì)的 NCX、SERCA2α、GAPDH基因片段大小一致 （圖5）。模型組NCX mRNA的表達(dá)比正常組顯著升高（P＜0.01）；硝苯吡啶組NCX mRNA的表達(dá)水平較模型組降低，存在顯著差異（P＜0.01）。模型組SERCA2αmRNA的表達(dá)比對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）；硝苯吡啶組SERCA2αmRNA的表達(dá)水平較模型組顯著增高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組NCX1mRNA和SERCA2αmRNA表達(dá)比較（±s，n＝10）

表4 各組NCX1mRNA和SERCA2αmRNA表達(dá)比較（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，●P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.01

組別 n NCX1／GAPDH SERCA2α／10 0.236±0.059 0.487±0.049模型組 10 0.457±0.068● 0.154±0.053●硝苯吡啶組 10 0.305±0.047★ 0.204±0.041 GAPDH對(duì)照組★

3 討論

一般所稱鈣拮抗劑（Calcium antagonists），是指阻滯離子從胞外經(jīng)鈣通道流入胞內(nèi)的藥物，能抑制跨膜鈣內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)的鈣釋放，降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度及其利用率，抑制ATP酶的活性，降低心肌收縮力；使平滑肌細(xì)胞松弛，血管擴(kuò)張，降低外周血管阻力［1］。由于鈣拮抗劑增加缺血區(qū)血流，負(fù)性肌力作用又降低了局部代謝，有利于維持缺血心肌的氧供需平衡，因此可縮小缺血范圍，減輕局部代謝紊亂及再灌注性細(xì)胞損害的程度。鈣拮抗劑通過阻斷心肌細(xì)胞膜鈣通道，降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、拮抗鈣超載，治療心肌缺血再灌注損傷已成為目前的一種共識(shí)［2－5］。在心肌缺血后壞死尚未形成前給藥效果更佳。有報(bào)道證實(shí)［6］：應(yīng)用鈣離子拮抗劑對(duì)損傷的心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，對(duì)改善心肌功能有明顯的效果。

本實(shí)驗(yàn)為L(zhǎng)angendorff灌流裝置上行主動(dòng)脈逆行灌流，制備大鼠離體心臟缺血30min、再灌注120 min模型，模擬臨床上心肌缺血-再灌注損傷患者的病理生理過程，觀察硝苯吡啶對(duì)離體大鼠心臟的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，硝苯吡啶組心肌梗死面積較模型組、對(duì)照組明顯縮?。≒＜0.01），藥物對(duì)離體大鼠心肌有保護(hù)作用。MDA為氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其值間接反映機(jī)體組織細(xì)胞受自由基損傷程度；SOD為細(xì)胞內(nèi)一種抗氧化酶，它可清除超氧陰離子，保護(hù)機(jī)體免受氧自由基損傷，其值間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，缺血再灌注時(shí)自由基生成增加，同時(shí)其清除能力下降，脂質(zhì)過氧化加強(qiáng)；應(yīng)用藥物后冠脈灌流液中SOD活性明顯升高（P＜0.01）；MDA含量顯著下降（P＜0.01），證明藥物對(duì)大鼠心肌有保護(hù)。心肌細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2＋濃度升高可直接激活Ca2＋依賴性PKC（a），使其從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上或通過激活Ca2＋依賴性磷酯酶C使與其相聯(lián)的Gq蛋白激活不依賴于鈣的PKC-δ和PKC-ε，使其從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上。PKC的激活可引發(fā)底物蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、線粒體ATP敏感性鉀離子通道、腺苷、緩激肽、受體的信息傳遞等一系列變化，是一種重要的機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)中間環(huán)節(jié)，通過催化多種蛋白質(zhì)磷酸化，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，減輕細(xì)胞損傷。藥物組的PKC含量水平較模型組增多（P＜0.01）。本研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷心肌中PKC的表達(dá)較對(duì)照組大鼠心肌中測(cè)定量高，說明在缺血再灌注后，心肌產(chǎn)生損傷，PKC由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)，表達(dá)增多，以保護(hù)受損傷心肌。心肌缺血再灌注時(shí)，鈉鈣交換體（sodium-calcium exchanger，NCX）反向轉(zhuǎn)運(yùn)使Ca2＋內(nèi)流增加，導(dǎo)致細(xì)胞鈣超載，是缺血再灌注造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、心律失常和收縮功能障礙的重要機(jī)制［7］，正常心臟的NCX1和SERCA2α在細(xì)胞水平上保持相對(duì)平衡。NCX是缺血／再灌注時(shí) Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑［8，9］，阻斷NCX介導(dǎo)的鈣流入可得到良好的心肌保護(hù)作用［10］，肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA2α）主要作用是將胞質(zhì)內(nèi)Ca2＋攝回至肌漿網(wǎng)內(nèi)，藥物組NCX mRNA的表達(dá)水平較模型組降低，存在顯著差異（P＜0.01），藥物組SERCA2αmRNA的表達(dá)水平較模型組顯著增高（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)證明使用硝苯吡啶對(duì)離體大鼠心肌有保護(hù)作用。鈣拮抗劑Nifedipine減輕缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷，對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

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Protective Effect of Calcium Antagonist Nifedipine on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Isolated Rat Hearts

GU Si-yang，DENGLi-ju，JIANGHong－yu.（FirstHospital，JilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveStudy the protective effect of Calcium Antagonist Nifedipine，on myocardial ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts.MethodsRat myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by consisting of a 30min（reducing perfusion flow level of left and right coronary to 5%of the original irrigation flow）ischemic period and 2hreperfusion，the isolated rat hearts were perfused on modified Langendorff apparatus.The rats were divided into control group，ischemia／reperfusion（I／R）group，Nifedipine group，then detected the myocardial infarct area，the levels of SOD and MDA，and PKCδwere detected by immunoHistochemistry，Semi-quantitative RT-PCR was employed to measure the mRNA levels of NCX and SERCA2a.Results（1）Compared with the I／R group，the myocardial infarct area was significantly lower，（2）SOD activity increased significantly and MDA decreased significantly；（3）Nifedipine group，compared with model group，levels of PKC increased （P＜0.05）；（4）expression of NCX mRNA in Nifedipine group was lower than the model group，there were significant differences（P＜0.05）；expression of SERCA2αmRNA in Nifedipine group was significantly increased compared with the model group（P＜0.05）.ConclusionThe calcium antagonist Nifedipine on myocardial ischemia-reperfusion injury has a protective effect.

book=211,ebook=93

myocardial infarction；Nifedipine；Ischemia-reperfusion；NCX

R364.1

A

1007－4287（2012）02－0210－04

吉林省自然科學(xué)基金資助（201115066）

＊通訊作者

2011－01－08）