汪永強(qiáng)，殷運(yùn)忠，李傳達(dá)，袁平宗，羅 鵬，婁 沖

（1.內(nèi)江市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科／瀘州醫(yī)學(xué)院附屬內(nèi)江醫(yī)院，四川 內(nèi)江 641100；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，重慶 400016）

地高辛標(biāo)記DNA探針快速篩選腫瘤細(xì)胞株基因表達(dá)差異

汪永強(qiáng)1，殷運(yùn)忠1，李傳達(dá)1，袁平宗1，羅 鵬2，婁 沖1

（1.內(nèi)江市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科／瀘州醫(yī)學(xué)院附屬內(nèi)江醫(yī)院，四川 內(nèi)江 641100；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，重慶 400016）

目的 建立寡核苷酸探針正向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，快速篩選不同細(xì)胞株同一基因HIF-1a表達(dá)差異，探討斑點(diǎn)雜交篩選基因表達(dá)的可行性。方法將多種培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株提取總RNA后，點(diǎn)樣于尼龍膜上，與地高辛標(biāo)記的HIF-1a基因探針雜交，結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果比較。結(jié)果斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論用隨機(jī)引物地高辛標(biāo)記DNA探針可以快速篩查不同細(xì)胞株同一基因表達(dá)差異，可以作為研究腫瘤基因表達(dá)差異的工具。

地高辛；探針；腫瘤細(xì)胞；基因表達(dá)

（ChinJLabDiagn，2012，16：0204）

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的主要病因之一是癌基因的激活或抑癌基因的失活，目前臨床開展的腫瘤標(biāo)志物主要包括糖類、蛋白質(zhì)類以及激素類，對(duì)基因類腫瘤標(biāo)志物開展較少，因此，探討和尋找基因類腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法已受到廣泛關(guān)注［1，2］。缺氧是導(dǎo)致惡性實(shí)體腫瘤預(yù)后差的主要原因之一，缺氧誘導(dǎo)因子1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）是各種細(xì)胞對(duì)缺氧應(yīng)答的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)［3，4］，本研究擬用地高辛標(biāo)記 HIF-1acDNA探針，檢測(cè)各類腫瘤細(xì)胞株中 HIF-1a mRNA表達(dá)水平，并與RT-PCR法比較，探討斑點(diǎn)雜交方法篩選基因表達(dá)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

各類腫瘤細(xì)胞株（乳腺癌 MCF-7細(xì)胞，宮頸癌HeLA細(xì)胞，卵巢癌SKVO3細(xì)胞，肝癌HepG2，人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞）由重慶醫(yī)科大學(xué)組胚實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)系實(shí)驗(yàn)室保存，地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購自Roche公司，PCR相關(guān)試劑與RNA提取試劑Trizonl購自TaKaRA大連有限公司，引物參考 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 設(shè) 計(jì)［5］：HIF-1a：上 游 5′-CTCAAAGTCGGACAGCCTCA-3′，下游5′-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT-3′；β-actin，上游5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游5′-CTAGAAGCATTTGCGGTCGACGATGGAGGG-3′，由TaKaRA大連有限公司合成。

1.2 各腫瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)與缺氧處理

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，用胰酶消化后繼續(xù)傳代培養(yǎng)；懸浮腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期后傳代繼續(xù)培養(yǎng)。缺氧處理：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各腫瘤細(xì)胞置于5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)6h后，離心去上清后留沉淀加入Trizonl試劑提取總RNA。

1.3 DIG（地高辛）隨機(jī)引物法標(biāo)記HIF-1a﹑β-actin探針與標(biāo)記效率的檢測(cè)

按照Roche公司提供的說明進(jìn)行，提取細(xì)胞總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42℃，30min；99℃，5min，加入 HIF-1a﹑β-actin特異性引物做PCR擴(kuò)增與電泳，最后以膠回收的DNA作為作為隨機(jī)引物法標(biāo)記探針的摸板，將標(biāo)記好的DNA探針在尼龍膜上，免疫顯色后與陽性探針對(duì)比分析探針標(biāo)記效率。

1.4 斑點(diǎn)雜交

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組腫瘤細(xì)胞5×105個(gè)，分別提取總RNA后，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，依次點(diǎn)在尼龍膜上，每株細(xì)胞點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)，每個(gè)樣本點(diǎn)量為2μg，同時(shí)每個(gè)樣本設(shè)β-actin內(nèi)參對(duì)照，每株細(xì)胞點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)，每個(gè)樣本點(diǎn)量為2μg，在120℃下干烤固定30min、雜交、免疫顯色均按說明書進(jìn)行。

1.5 腫瘤細(xì)胞株HIF-1a基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各腫瘤細(xì)胞5×105個(gè)，采用Trizol試劑分別提取各組細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42℃，30min；99℃，5min。PCR反應(yīng)條件為：95℃2min，95℃35s，56℃35s，72℃50 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參，最后取5.0μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（180v，20min）鑒定，采用凝膠圖像分析儀分別測(cè)定每個(gè)樣本HIF-1a和β-action條帶的V值（Volume＝平均光密度值×條帶面積），以DL，2000DNA Ladder測(cè)定分子量，算出各樣本HIF-1a表達(dá)強(qiáng)度Rv＝V［目的基因］／Vβ-action。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 地高辛標(biāo)記DNA探針的效率檢測(cè)

與地高辛標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA相比，HIF-1a基因探針可以檢測(cè)到0.1pg的mRNA，用此種探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，靈敏度較高。如圖1。

圖1 地高辛標(biāo)記HIF-1aDNA探針效率

2.2 斑點(diǎn)雜交結(jié)果

五種腫瘤細(xì)胞的RNA提取后，點(diǎn)樣于尼龍膜上，用HIF-1a與β-action探針分別雜交后，每一樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，免疫顯示如圖2，Rv值如圖3，乳腺癌 MCF-7細(xì)胞 HIF-1a表達(dá)的Rv值為0.935；宮頸癌HeLA細(xì)胞為0.874，卵巢癌SKVO3細(xì)胞為0.797；肝癌HepG2細(xì)胞為0.824；人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為0.778。

圖2 斑點(diǎn)雜交分析HIF-1a基因的表達(dá)

圖3 RT-PCR分析 HIF-1a基因的表達(dá)

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

五種培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞分別提取RNA后，用HIF-1a特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)以βactin作為內(nèi)參，最后取5.0μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（180v，20min）（圖3），每一樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，圖像顯示灰度值，乳腺癌MCF-7細(xì)胞HIF-1a表達(dá)的Rv值為0.926；宮頸癌HeLA細(xì)胞為0.884，卵巢癌 SKVO3 細(xì)胞為 0.782；肝癌HepG2細(xì)胞為0.817；人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞為0.786。如圖4。

2.4 斑點(diǎn)雜交與RT-PCR結(jié)果比較

將五種腫瘤細(xì)胞中HIF-1a基因表達(dá)分別用斑點(diǎn)雜交法與RT-PCR法檢測(cè)，其定量值用Rv表示，用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明：斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），如圖4。

3 討論

圖4 用斑點(diǎn)雜交與RT-PCR檢測(cè)各種腫瘤細(xì)胞HIF-1amRNA表達(dá)Rv值

缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1是在缺氧條件下廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1a和HIF-1β構(gòu)成，HIF-1β在低氧環(huán)境和常氧環(huán)境下在細(xì)胞核均有表達(dá)，當(dāng)環(huán)境氧濃度＞5%時(shí)，HIF-1a上的氧依賴降解區(qū)與E3泛醌連接酶結(jié)合通過泛素蛋白酶體途徑將HIF-1a迅速降解，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧環(huán)境下時(shí)，阻礙了泛素蛋白酶對(duì)HIF-1a的降解作用致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HIF-1a積聚增加，因此，HIF-1a是HIF-1的氧調(diào)節(jié)亞單位；HIF-1a的主要作用是腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)基因過表達(dá)，其結(jié)果是促進(jìn)腫瘤血管形成、細(xì)胞能量代謝旺盛、腫瘤轉(zhuǎn)移能力加強(qiáng)。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道HIF-1a基因在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等實(shí)體腫瘤中均過表達(dá)，并且與凋亡抑制蛋白等有良好的相關(guān)性，表明HIF-1a是腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下惡性增殖與轉(zhuǎn)移的主要原因之一，因此檢測(cè)HIF-1a的表達(dá)有助于了解腫瘤細(xì)胞惡性增殖與轉(zhuǎn)移情況［6］。

本研究通過提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)成cDNA后，用HIF-1a特異性引物擴(kuò)增該模板，膠回收擴(kuò)增DNA片段，采用地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記方法標(biāo)記HIF-1a基因DNA探針，通過標(biāo)記效率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：該探針可以檢測(cè)到樣本中0.1pg的mRNA，說明標(biāo)記效率與靈敏度都較高。此標(biāo)記方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要將標(biāo)記產(chǎn)物分離與純化，操作非常簡(jiǎn)便，另外，由于標(biāo)記的是DNA探針，因此標(biāo)記好的探針可以回收后反復(fù)利用，有效避免了RNA探針容易降解的缺點(diǎn)。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)表明：回收的探針用于分子雜交并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度與雜交背景。為了比較斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的可行性，本研究將五種培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞（乳腺癌MCF-7細(xì)胞、宮頸癌HeLA細(xì)胞、卵巢癌SKV3細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞與人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞）分別提取RNA后，同時(shí)用RT-PCR方法與斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)行檢測(cè)HIF-1amRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示兩種檢測(cè)基因表達(dá)的方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明斑點(diǎn)雜交檢測(cè)基因表達(dá)是可行的。此外，由于分子雜交方法的特異度明顯高于基因擴(kuò)增方法，所以分子雜交還可以檢測(cè)基因突變等現(xiàn)象，可以有效篩選出腫瘤突變基因的存在。

本研究成功制備了地高辛標(biāo)記的HIF-1a基因探針，建立了腫瘤細(xì)胞中顯示基因表達(dá)差異的方法，為下一步研究HIF-1a基因的功能奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

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Detection of gene expression difference in tumor cell lines rapidly with DNA probe-labeled by Digoxin

WANGYongqiang，YINYun-zhong，LIChuan-da，etal.（TheSecongHospitalofNeijiangCity／TheAffiliatedNeijiangHospital，LuzhouMedicalUniversity，Neijiang641100，China）

ObjectiveTo estabilish dot blot hybridization technology in the detection of HIF-1agene expression of various tumor cells and to explore the availability of dot blot in screening gene expression difference.MethodsNuclear acid were extracted from a variety of cultured tumor cell lines and spotted on the nylon membrane，dot blot analysis and semi-quantitative RT-PCR were carded out respectively to detect HIF-1agene expression.ResultsThe dot-blot hybridization results are consistent with the RT-PCR.it did not reach the conventional level of statistical significance（P＞0.05）.ConclusionDot blot hybridization with DIG-labeled HIF-1aprobe can be used to screen quickly gene expressing difference in tumor cells and serve as a research tool for tumor gene expression difference.

Digoxin；probe；tumor cells；gene expression

Q786 R730.2

A

1007－4287（2012）02－0204－03

吳階平醫(yī)學(xué)基金（FWMN-2011L007）

汪永強(qiáng)（1978－），男，檢驗(yàn)師，碩士研究生，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)分子診斷方向研究與工作。

2010－05－24）