王青元，朱 靖，周 穎，許乾乾，朱圓圓，凌 斌

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 婦產(chǎn)科分子實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230001）

GRIM-19及其截?cái)囿w原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)與純化

王青元，朱 靖，周 穎，許乾乾，朱圓圓，凌 斌＊

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 婦產(chǎn)科分子實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230001）

目的 構(gòu)建GRIM-19及其截?cái)囿w原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化融合蛋白。方法用RTPCR法從HeLa細(xì)胞中擴(kuò)增出帶BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)的GRIM-19及其截?cái)囿w基因片段，將GRIM-19及其截?cái)囿w基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表達(dá)載體上，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)GST-GRIM-19及其截?cái)囿w融合蛋白，用Glutathione Sepharose 4B純化，純化后蛋白經(jīng) Western-blot鑒定。結(jié)果pGEX-4T-3-GRIM-19及其截?cái)囿w原核表達(dá)載體構(gòu)建正確，并在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)以濃度0.5mM，時(shí)間2h為宜，且通過Glutathione Sepharose 4B成功純化到融合蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建GRIM-19及其截?cái)囿w原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化GST-GRIM-19及其截?cái)囿w融合蛋白。

GRIM-19；誘導(dǎo)表達(dá)；純化

（ChinJLabDiagn，2012，16：0191）

GRIM-19（gene associated with retinoid-interferon mortality-19，GRIM-19），是 GRIMs家族的重要成員［1］，是2000年 Angell等［2］發(fā)現(xiàn)的由IFN 聯(lián)合RA誘導(dǎo)表達(dá)的一種新的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，定位于19p13.2，該區(qū)的多種基因?yàn)榍傲邢侔┑囊种苹颉⑴c細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控過程，其表達(dá)降低或位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，GRIM-19在多種正常組織中表達(dá)，參與IFN／RA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生［3］。本實(shí)驗(yàn)我們利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建了GRIM-19及其截?cái)囿w原核表達(dá)載體，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)pGEX-4T-3載體質(zhì)粒啟動(dòng)子，成功誘導(dǎo)了GST-GRIM-19及其截?cái)囿w的融合蛋白的表達(dá)，為今后研究GRIM-19的分子生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，DEPC購自Sigma公司，TaqDNA聚合酶購自TakaRa公司，小劑量質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，XhoⅠ及DNA連接酶均購自TaKaRa公司，IPTG購自天根公司，GST純化試劑盒Glutathione Sepharose 4B購自GE公司，GST單抗購自GE公司，Westernblot化學(xué)發(fā)光底物購自PIERCE公司，BL21、pGEX-4T-3載體質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 pGEX-4T-3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 參考分子克隆第3版中感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法和步驟等［4］，制備氨芐抗性的LB平板、BL21感受態(tài)細(xì)菌以及將pGEX-4T-3載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)分離鑒定，得到含pGEX-4T-3的對照菌。

1.2.2 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截?cái)囿w引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中GRIM-19堿基序列，通過Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行分析后設(shè)計(jì)出GRIM-19及其截?cái)囿w上下游引物（見表1），分別在GRIM-19的第35位氨基酸和第70位氨基酸位點(diǎn)截?cái)啵ㄈ绫?），引物分別加入了BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)（斜體字部分）。

表1 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截?cái)囿w引物設(shè)計(jì)

1.2.3 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截?cái)囿w原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用trizol法提取HeLa細(xì)胞中總RNA，以O(shè)ligod（T）18為逆轉(zhuǎn)錄引物，以提取的總RNA為模板，在M-mlv反轉(zhuǎn)錄酶催化下反轉(zhuǎn)錄出cDNA，用上述特異性引物，采用TaKaRa Prime-STAR HS DNA聚合酶進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件：98℃5min 1個(gè)循環(huán)，98℃10s66℃5s，72℃30s共35個(gè)循環(huán)，72℃10min 1個(gè)循環(huán)。各取100μl PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳。依據(jù)TaKaRa膠回收純化試劑盒操作規(guī)程，膠回收純化目的片段，將GRIM-19及其截?cái)囿w編碼區(qū)片段與載體pGEX-4T-3分別用BamHⅠ、XhoⅠ酶切，膠回收獲得酶切后pGEX-4T-3載體片段和GRIM-19及其截?cái)囿w編碼區(qū)片段，然后用TaKaRa T4DNA連接酶，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)大腸桿菌，涂板（氨芐抗性），過夜生長。各挑取10個(gè)單克隆菌落于1ml氨芐抗性LB中生長4－6 h，無菌條件下取微量菌液做菌液PCR初篩，陽性者繼續(xù)搖晃生長過夜。參照Axygen質(zhì)粒小量提取試劑盒操作規(guī)程提取純化pGEX-4T-3-GRIM-19及其截?cái)囿w質(zhì)粒，BamHⅠ、XhoⅠ酶切質(zhì)粒，瓊脂凝膠電泳鑒定為陽性者，送到上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 對照菌和重組菌分別涂板（氨芐抗性），37℃生長12h，各挑取1個(gè)菌落接種于1ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)物按1∶10接種于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.5－1；吸出1ml培養(yǎng)物放入1.5ml EP管中，－20℃保存并記錄各自O(shè)D600值，其余的培養(yǎng)物中加入IPTG（終濃度0.5mM），30℃震蕩培養(yǎng)2h，取1ml樣品放入1.5ml EP管中，分別測OD600值，室溫12 000rpm離心1min，沉淀重懸于40μl的2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮3min，室溫12 000rpm離心1min，上清按0.15OD量上樣于15%的SDS-PAGE膠，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察表達(dá)產(chǎn)物條帶。

1.2.5 融合蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)后的對照菌和重組菌分別用1×PBS重懸后，加入終濃度為1mM的Cocktail，1 280Kpa高壓勻漿法破碎。4℃，12 000rpm離心30min，按照Glutathione Sepharose 4B純化試劑盒說明書，上清加入Glutathione Sepharose 4B，4℃搖晃孵育2h。4℃，500g離心5min，沉淀用pH8.0的GSH Elution buffer洗脫，蛋白上清定量備用。

2 結(jié)果

2.1 GRIM-19及其截?cái)囿w編碼區(qū)片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

DNA marker為DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示在432bp、105bp、105bp、222bp位置出現(xiàn)的特異性目的片段，與所設(shè)計(jì)的GRIM-19及其截?cái)囿w編碼區(qū)片段大小一致（圖1）。

圖1 GRIM-19及其截?cái)囿w編碼區(qū)片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截?cái)囿w重組質(zhì)粒酶切鑒定、測序

經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后出現(xiàn)分子量分別為4 900bp和432bp、105bp、105bp、222bp的特異性條帶，正好與線性質(zhì)粒pGEX-4T-3和GRIM-19及其截?cái)囿w編碼區(qū)片段的分子量一致（圖2）。將pGEX-4T-3-GRIM-19及其截?cái)囿w重組質(zhì)粒送到上海生工生物工程有限公司測序鑒定，測序結(jié)果均與目的序列完全相同，表明構(gòu)建載體成功。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖

2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

對照菌和重組菌經(jīng)0.5mM IPTG，30℃，誘導(dǎo)2h后，變性上樣于15%的SDS-PAGE膠，考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)對照菌在26KD處出現(xiàn)很強(qiáng)條帶，各重組菌分別在43KD、30KD、30KD、33KD處可見較強(qiáng)條帶（圖3），表明誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖3 考馬斯亮藍(lán)染色檢測目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

2.4 融合蛋白純化后的western-blot檢測

將純化好的GST及GST-GRIM-19及其截?cái)囿w融合蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，經(jīng)封閉后室溫孵育一抗GST（1∶4 000）2h，TBS-T洗后加入相應(yīng)的二抗孵育2h，膜經(jīng)TBS-T洗后與ECL發(fā)光檢測劑結(jié)合，經(jīng)X片壓片曝光，顯示結(jié)果（圖4）。

圖4 Western-blot檢測目的蛋白的表達(dá)

3 討論

GRIM-19是新發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞線粒體呼吸作用和細(xì)胞凋亡調(diào)控的新基因，主要表達(dá)在線粒體中，細(xì)胞核中微量表達(dá)［5］。GRIM-19蛋白由144個(gè)氨基酸組成，分子量約16KD，是線粒體中NADH脫氫酶復(fù)合體的基本亞單位，在Ⅰ型呼吸過程中發(fā)揮著重要作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，GRIM-19在甲狀腺腫瘤、腎癌、口腔癌以及結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)降低［7］。本實(shí)驗(yàn)組前期研究發(fā)現(xiàn)在子宮頸鱗癌和卵巢癌中，GRIM-19的表達(dá)降低且與癌基因STAT3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［8］。Lufei等［9］發(fā)現(xiàn)IFN／RA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程中上調(diào)了細(xì)胞中GRIM-19的表達(dá)。抑制GRIM-19的表達(dá)，IFN／RA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用減弱。反之，增加GRIM-19的表達(dá)則顯著增加細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，我們將GRIM-19基因分成三段。Kalvakolanu等［10］發(fā)現(xiàn) GRIM-19①與抗腫瘤功能密切相關(guān)。Lufei等［9］發(fā)現(xiàn)GRIM-19②能夠與STAT3結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的作用，從而拮抗STAT3激活所致的細(xì)胞永生化改變。GRIM-19③的功能目前不清楚。

大腸桿菌體外表達(dá)系統(tǒng)由于其遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面已充分被人們了解而成為許多異源蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因融合系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用于分子免疫學(xué)和分子生物學(xué)的研究以及疫苗的生產(chǎn)。天然GST蛋白相對分子質(zhì)量為26KD，pGEX系列質(zhì)粒是目前較為常用的GST融合表達(dá)系統(tǒng)載體。本文選擇的pGEX-4T-3大小為4.9KD，該載體含tac啟動(dòng)子和lacIq基因。未誘導(dǎo)條件下lacIq基因產(chǎn)物能結(jié)合在tac上，阻止tac啟動(dòng)子；IPTG誘導(dǎo)后，lacIq基因產(chǎn)物即從tac上釋放出來，tac啟動(dòng)子被誘導(dǎo)啟動(dòng)表達(dá)，tac啟動(dòng)子后面的GST標(biāo)簽和外源性蛋白就能夠表達(dá)出來［11］。同時(shí)該載體表達(dá)的外源蛋白可以通過Glutathione Sepharose 4B純化得到特異性蛋白。

在誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)及純化的過程中，IPTG的濃度、作用時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及裂菌的方式對融合蛋白的表達(dá)和純化影響很大，因此，必須通過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)來探索最佳IPTG濃度、作用時(shí)間和誘導(dǎo)溫度等。本實(shí)驗(yàn)在前期摸索試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用0.5mM IPTG，30℃，誘導(dǎo)2h等最佳誘導(dǎo)條件，既防止大量IPTG產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用、高溫條件下蛋白容易出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊和形成包涵體又能滿足外源蛋白大量表達(dá)的要求。

本實(shí)驗(yàn)中，我們成功構(gòu)建了GRIM-19及其截?cái)囿w的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中通過IPTG成功誘導(dǎo)GRIM-19及其截?cái)囿w融合蛋白表達(dá)并使用Glutathione Sepharose 4B試劑盒法得到純化蛋白。下一步，我們將借助溶血酶去掉GST標(biāo)簽得到裸的GRIM-19蛋白或者直接使用融合蛋白進(jìn)行GRIM-19的體外生物學(xué)功能研究。

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Construction of GRIM-19and Its Truncated body prokaryotic expression vector and fusion protein induced expression and purification

WANGQing－yuan，ZHUJing，ZHOUYing，etal.（MolecularlaboratoryDepartmentofObstetricsand Gynecology，AnhuiProvincialHospitalaffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity，Hefei230001，China）

ObjectiveTo construct the GRIM19and its truncated body prokaryotic expression vector，express the Fusion protein in E.coli and purify the expressed product.MethodsGRIM-19Its Truncated body gene sequence with BamHⅠand XhoⅠ，restriction enzyme cutting site were amplified from total RNA of HeLa cell line by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR），then the GRIM-19its truncated body gene sequence was inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-3，induced express the fusion protein in E.coli and purified by Glutathione Sepharose 4B，Western-blot were used to test the fusion protein.ResultsThe pGEX-4T-3-GRIM-19its truncated body prokaryotic expression vector was constructed correctly and the fusion protein was correctly inducted expression，the optimal concentration and time of IPTG for induction was 0.5mM and 2h，and the fusion protein was successfully purified.ConclusionThe pGEX-4T-3-GRIM-19and its truncated body prokaryotic expression vector was successfully constructed，Inducible expression and purification of GST-GRIM-19and its truncated body fusion protein.

GRIM-19；inducible expression；purification

R730.231

A

1007－4287（2012）02－0191－04

國家自然科學(xué)基金資助（81072127、81001168）

＊通訊作者

2011－08－16）