侯睿智，安治國(guó)，魏 君，毛靜濤，侯治富＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.北京龍邁達(dá)科技有限公司，北京 100176）

大腸癌易感基因hMLH1、hMSH2的篩查

侯睿智1，安治國(guó)1，魏 君1，毛靜濤2，侯治富1＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.北京龍邁達(dá)科技有限公司，北京 100176）

目的 探討hMLH1、hMSH2基因多態(tài)性與大腸癌發(fā)病危險(xiǎn)的研究。方法采用大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，運(yùn)用PCR和DNA直接測(cè)序方法，篩查外周血單個(gè)核細(xì)胞DNAhMLH1、hMSH2基因多態(tài)性。結(jié)果大腸癌組hMLH1-exon12 1151T→A的突變陽性率為12.20%，與對(duì)照組（6.10%）相比，無顯著差異（P＞0.05）；而hMSH2-exon1 IVS1＋9C→G的突變陽性率為46.70%，與對(duì)照組（33.33%）相比差異顯著（P＜0.05）。在各年齡組間，hMLH1-exon12、hMLH1-exon12突變無顯著性差異（P＞0.05）。危險(xiǎn)性分析表明，攜帶hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發(fā)生大腸癌的相對(duì)危險(xiǎn)性為無基因突變組的1.75倍，若不攜帶基因突變，其腸癌發(fā)病率將降低42.9%；若在人群中無hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發(fā)生，則大腸癌的發(fā)病率將降低20%。結(jié)論hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變可作為大腸癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素，并可作為檢測(cè)指標(biāo)。

大腸癌；多態(tài)性；hMSH2

（ChinJLabDiagn，2012，16：0049）

hMSH 2基因位于染色體區(qū)域2p 21，在遺傳連鎖分析中，是最早被確定的影響遺傳性非息肉性大腸癌（HNPCC）綜合征的一個(gè)重要的候選基因。其編碼產(chǎn)物hMSH 2蛋白與hMSH 6或hMSH 3形成異二聚體，并以異二聚體復(fù)合物的形式識(shí)別、結(jié)合DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤位點(diǎn)，借以消除子代序列中的錯(cuò)誤，使DNA復(fù)制按照母模板序列正常復(fù)制。

hMLH1基因位于染色體3p 21－23，與hMSH 2基因一樣與HNPCC有關(guān)。其基因編碼產(chǎn)物hMLH1蛋白本身無酶活性，與hMLH3，hPMS2或hPMS1形成異二聚體，借以結(jié)合其他的DNA修復(fù)蛋白。

早期的研究表明，hMSH2基因的16個(gè)外顯子和hMLH1基因的19個(gè)外顯子都能發(fā)生致病性突變。目前尚沒有關(guān)于這兩個(gè)基因致病性突變、或是多態(tài)性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。在本項(xiàng)研究中，試圖通過大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，探索在大腸癌中這種突變的致病性或致病危險(xiǎn)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 患者選擇與分組150例大腸癌患者均為2007年－2009年吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院住院病例。其中，男性86例，女性64例；平均年齡為49.5歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)采用全國(guó)大腸癌病理研究協(xié)作組2002年制定的《全國(guó)大腸癌病理研究統(tǒng)一規(guī)范》。另選取150例健康體檢者作為對(duì)照，其中男性79例，女性71例；平均年齡47歲。

1.2 去靜脈全血，分離單個(gè)核細(xì)胞提取DNA，用QIAGEN旋轉(zhuǎn)柱純化樣本。

1.3 PCR擴(kuò)增目的基因片段由寶生物工程（大連）有限公司合成引物。hMLH1-exon12上游引物5′-ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG-3′，下 游引 物 5′-TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG-3′。hMSH2-exon1上游引物 5′-TCGCGCATTTTCTTCAACC-3′，下 游 引 物 5′-GTCCCTCCCCAGCACGC-3′。PCR循環(huán)參數(shù)為：充分變性95 ℃、5 mins，變性95℃、40s，退火55℃、40s，延伸72℃、60s。35個(gè)循環(huán)，再充分延伸72℃、5mins。經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4 DNA序列測(cè)定PCR反應(yīng)管內(nèi)加入1μl的3M醋酸鈉，1μl EDTA和25μl無水乙醇，吹打混合均勻。室溫放置15－30min，12 000rpm，4℃15－20min離心，小心吸棄溶液，加入70%的乙醇漂洗，12 000rpm，4℃8－10min離心，再次加入70%的乙醇漂洗，上述條件離心，開蓋閉光晾置，至殘余酒精徹底揮發(fā)干凈，使PCR產(chǎn)物純化。加入10μl hidi（甲酞胺），95℃變性2－3min，立即冰浴，即可上機(jī)。比較在測(cè)序圖上的相應(yīng)堿基序列峰型，如果出現(xiàn)峰型重疊，根據(jù)峰型的顏色、波幅，判定置換的堿基。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)hMSH2基因IVS1＋9C→G、hMLH1基因1151T→A多態(tài)性進(jìn)行危險(xiǎn)度（Risk）分析和等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)150例健康體檢者、150例大腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA進(jìn)行hMLH1-exon12、hMSH2-exon1 擴(kuò) 增 后，分 別 在 216bp 和281bp處獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物。其中有147例健康體檢者、82例大腸癌標(biāo)獲得hMLH1-exon12擴(kuò)增出結(jié)果；126例健康體檢者、90例大腸癌標(biāo)本獲得hMSH2-exon1擴(kuò)增出結(jié)果。

2.2 DNA序列分析結(jié)果對(duì)147例健康體檢者和82例大腸癌患者h(yuǎn)MLH1-exon12擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析（結(jié)果見表1，2）。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，大腸癌組的突變陽性率為12.20%，與對(duì)照組（6.10%）相比，無顯著差異（P＞0.05）。

Tab.1 hMLH1-exon12 1151T→A in colorectal cancer patients

Tab.2 hMLH1-exon12 1151T→A in colorectal cancer of different ages

在各年齡組間，hMLH1-exon12 1151T→A突變陽性率的Kendall等級(jí)相關(guān)分析表明，無顯著性差異，χ2近似于零，P＞0.05）。

對(duì)126例健康體檢者和90例大腸癌患者h(yuǎn)MSH2-exon1擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析（結(jié)果見表3，4）。

Tab.3 hMSH2-exon1IVS1＋9C→G in colorectal cancer patients

結(jié)果表明，大腸癌組的突變陽性率為46.70%，與對(duì)照組（33.33%）相比差異顯著（P＜0.05）。

危險(xiǎn)性分析表明，攜帶hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發(fā)生大腸癌的相對(duì)危險(xiǎn)性（OR）為無基因突變組的1.75倍；在對(duì)照組中，若不攜帶基因突變，其腸癌發(fā)病率將降低42.9%（特異危險(xiǎn)性百分比AR%）；若在人群中無hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發(fā)生，則大腸癌的發(fā)病率將降低20%（人群特異危險(xiǎn)性百分比PAR%）。

Tab.4 hMSH2-exon1IVS1＋9C→G in colorectal cancer of different ages

在各年齡組間，hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變陽性率的Kendall等級(jí)相關(guān)分析表明，無顯著性差異（χ2＝0.139，P＞0.05）。

3 討論

大腸癌（Colorectal cancer，CRC）是全球第三個(gè)最常見的癌癥，位居肺癌和乳腺癌癌癥之后。60%發(fā)生在較發(fā)達(dá)地區(qū)。按年齡標(biāo)準(zhǔn)化率和累計(jì)計(jì)算，0－74歲人群中大腸癌的發(fā)病率和死亡率有明顯的地理變異。在世界各地，捷克發(fā)病率最高（43／10萬），非洲（3.6／10萬，除南非）和中南亞（4.5／10萬）發(fā)病率最低。歐洲CRC死亡率最高，中非地區(qū)死亡率最低。

根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部2002年的報(bào)告，結(jié)直腸癌的發(fā)病率已由70年代的第6位升至90年代的第3位，并且年死亡率上升至10.25／10萬，在世界范圍內(nèi)處于較低水平［1－4］。

大腸癌的確切病因仍不清楚，隨著人們對(duì)家族性腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性大腸癌認(rèn)識(shí)的深入，追尋遺傳標(biāo)志篩查大腸癌成為當(dāng)今的熱點(diǎn)。本課題組的前期研究也表明，大腸癌p53基因突變率為44%，并于ras基因協(xié)同突變［5，6］。揭示了大腸癌發(fā)生演變中的遺傳因素的作用。

關(guān)于MMR基因突變，國(guó)內(nèi)外有較多的文獻(xiàn)報(bào)道。特別是在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）的研究中，己有大量的錯(cuò)配修復(fù)基因突變資料的積累。在HNPCC中絕大多數(shù)的腫瘤是由hMSH2和hMLH1基因的胚系突變引起的，其中hMSH2基因的突變占31%，hMLH1占33%。在散發(fā)性結(jié)腸癌和胃癌中，己報(bào)道的hMLH1基因的突變（42%），較hMSH2基因高（8%）［7］。

有研究發(fā)現(xiàn)，至少在白人中hMLH1的 WS14－19多態(tài)位點(diǎn)的A和G兩種基因型，預(yù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)提示這種多態(tài)與部分直腸癌的發(fā)病有關(guān)。Hutter等報(bào)道，在結(jié)直腸癌患者中hMLH1的突變型IVS14-19G基因型較正常人群的高，分別為55.5%和39.2%，相關(guān)危險(xiǎn)性G是A的1.93倍。除了荷蘭患者組，其余各組亦得到相同結(jié)果。錯(cuò)配修復(fù)基因PMs2中的SNPs與MLH1之間存在蛋白水平的相互作用，可導(dǎo)致基因的改變，進(jìn)而影響表達(dá)蛋白的功能，這三種多態(tài)均增加了HNPCC發(fā)生危險(xiǎn)［7］。

本研究采用了PCR-DNA Direct sequencing技術(shù)，針對(duì)大腸癌患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的DNA進(jìn)行了檢測(cè)，進(jìn)一步深入研究hMSH2和hMLH1基因多態(tài)與大腸癌發(fā)病的相關(guān)性和危險(xiǎn)性。研究結(jié)果表明，hMLH1-exon12 1151T→A突變陽性檢出率，大腸癌組為12.20%，與對(duì)照組（6.10%）相比，無顯著差異（P＞0.05）。在各年齡組間的Kendall等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果無顯著性差異（χ2近似于零，P＞0.05）。在hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變分析中，大腸癌組的突變陽性率為46.70%，顯著高于對(duì)照組（33.33%）（P＜0.05）。進(jìn)一步的危險(xiǎn)性分析提示，攜帶hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發(fā)生大腸癌的相對(duì)危險(xiǎn)性（OR）為無基因突變組的1.75倍；在對(duì)照組中，若不攜帶基因突變，其腸癌發(fā)病率將降低42.9%（特異危險(xiǎn)性百分比AR%）；若在人群中無hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發(fā)生，則大腸癌的發(fā)病率將降低20%（人群特異危險(xiǎn)性百分比PAR%）。在各年齡組間，hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變陽性率的Kendall等級(jí)相關(guān)分析無顯著性差異（χ2＝0.139，P＞0.05）。

盡管這一結(jié)果與國(guó)外有關(guān)大腸腫瘤hMLH1基因和hMSH2基因變異的蛋白表達(dá)水平研究結(jié)果不完全一致，但結(jié)果提示，hMSH2基因突變不僅與HNPCC的發(fā)病有關(guān)，而且與一定比例散發(fā)性大腸癌有關(guān)，并且認(rèn)為hMSH2基因是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致腫瘤抑制的一個(gè)重要機(jī)制。因此，篩查hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變，仍然可以作為大腸腫瘤篩查、早期診斷的參考指標(biāo)。

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Screening of susceptible gene hMLH1and hMSH2in Colorectal cancer

HOURui-zhi，ANZhi-guo，WEIJun，etal.（China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033，China）

ObjectiveTo explore the hMLH1，hMSH2gene polymorphisms and colorectal cancer risk.MethodsUsing large sample randomized controlled trials，hMLH1，hMSH2gene polymorphism of peripheral blood mononuclear cells DNA were screened by PCR and DNA direct sequencing.ResultshMLH1-exon12 1151T-＞A mutation in colorectal cancer group was 12.20%，there is no significant difference comparing with control group（6.10%）（P＞0.05）；hMSH2-exon1IVS1＋9C-＞G mutation（46.70%）was significantly higher than control group（33.33%）（P＜0.05）.But there is no significant difference in ages（P＞0.05）.Risk analysis shows that，the relative risk with hMSH2-exon1IVS1＋9CG mutations in colorectal cancer is 1.75times of control group.The incidence of colorectal cancer will be reduced by 42.9%if it do not carry the gene mutation，and be reduced by 20%in population.ConclusionhMSH2-exon1IVS1＋9C-＞G mutation can be used as the pathogenesis of colorectal cancer risk factors，and can be used as the testing index.

Colorectal cancer；polymorphism；hMSH2

1007－4287（2012）01－0049－03

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（200705308，20090738）

＊通訊作者

R735.3＋4

A

2010－11－29）