許哲男，鄭向宇，趙 維，辛 華，韓振國＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室）

氯通道是分布于細(xì)胞膜上對(duì)氯離子或其他陰離子有通透性的電壓門控氯通道（voltage－gated Cl channel，ClC），哺乳動(dòng)物共有9個(gè)亞型，廣泛存在于機(jī)體的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，參與細(xì)胞的多種活動(dòng)和功能調(diào)節(jié)過程。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中都存在ClC－2蛋白的過度表達(dá)和處于磷酸化狀態(tài)。本研究以非小細(xì)胞肺癌為研究對(duì)象，與正常肺組織作為對(duì)比，探討氯離子同通道ClC－2在非小細(xì)胞肺癌及肺部疾病中表達(dá)情況，亦探明氯離子通道ClC－2作為治療非小細(xì)胞肺癌的基因靶位提供有利的依據(jù)，為治療該腫瘤提供新的理論根據(jù)及途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)分組 正常肺組織為對(duì)照組，肺鱗癌、肺腺癌、肺良性病灶為實(shí)驗(yàn)組。肺良性病灶以肺結(jié)核為主，部分為肺大泡和炎性假瘤。組織標(biāo)本購于吉林大學(xué)組織標(biāo)本庫，均收集于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科2008.05－2009.08經(jīng)手術(shù)切除后保存的新鮮冷凍組織，提供標(biāo)本的患者術(shù)前未經(jīng)放、化療等系統(tǒng)抗癌治療。

1.1.2 試劑 總RNA提取Trizol試劑盒購于Invitrogen公司，PCR試劑購自TaKara公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒，核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品，Taq酶，人ClC－2抗體（購自美國Santa Cruz公司）為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的人抗體為二抗，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，M－MuLV RT、5XBuffer，M－MuLV RT Oligo d（T）Primers、購自（寶生物，日本），免疫組化超敏Ultrasensitive S－P試劑盒和DAB顯示試劑盒（福州邁新公司），所有抗體均為即用型。

1.1.3 設(shè)備 低溫高速離心機(jī)（久保田，日本），722分光光度計(jì)（上海儀器廠），PCR儀（TAKARA，日本），全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon，中國），電泳儀（Bio－rad，美國），蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（BioBrad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR 檢測(cè)ClC－2mRNA的表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑盒，按照試劑盒使用說明書對(duì)肺鱗癌及腺癌；肺良性病灶，正常肺組織分別提取總RNA。以上述所得總RNA為模板、Oligo（dT）為mRNA引物，應(yīng)用SuperScriptⅡ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，用人ClC－2特異性引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR特意擴(kuò)增，詳細(xì)操作步驟參見說明書。ClC－2引物序列

forward5′－AGGCTTCTGTCTGCTTCCA－3′；Reverse5′－TTCCAATGAGTCTGCCAATAC－3′。擴(kuò)增的產(chǎn)物cDNA3′端大小約477bp。獲得RTPCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗(yàn)，用以上的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.2.2 Western blot檢測(cè)ClC－2蛋白的表達(dá) 按試劑盒說明書操作。采用凝膠成像系統(tǒng)攝像，軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR

利用ClC－2特意引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在與DL2000DNA marker對(duì)應(yīng)的250－500bp之間非小細(xì)胞肺癌組有一明顯特異片段，肺良性病和正常肺組中其顯示微弱，再與每個(gè)樣品測(cè)得的目的基因含量與本樣品的GAPDH含量相除，得到每個(gè)樣品目的基因的相對(duì)含量，然后才進(jìn)行樣品與樣品之間的比較。結(jié)果表明非小細(xì)胞肺癌ClC－2基因表達(dá)量明顯增加（見圖1）。

圖1 RT－PCR檢測(cè)ClC－2及GAPDH的電泳結(jié)果

2.2 Western Blot

檢測(cè)結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組中ClC－2蛋白在98KD出有一條明顯特征帶，ClC－2／β－Actin趨勢(shì)比較，表明非小細(xì)胞肺癌中鱗癌表達(dá)量最高，其次肺腺癌及良性病灶表達(dá)無明顯差距，相比正常肺組織中ClC－2蛋白表達(dá)量比實(shí)驗(yàn)組降低，每組中氯離子通道ClC－2均有一定的表達(dá)（見圖2）。

圖2 Westemblot檢測(cè)ClC－2蛋白的表達(dá)

3 討論

ClC屬電壓門控性通道（voltage－gated chloride channels，ClC），在細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)、細(xì)胞電位、細(xì)胞器的酸化及pH的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，免疫細(xì)胞的募集及激活等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用［1，2］，近年來研究發(fā)現(xiàn)電壓門控性氯離子通道在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，且可能在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、演化、增殖、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性等惡性生物學(xué)行為中可能起重要作用［3，4］。

ClC－2是ClC的一員，其分布廣泛，在大腦，腎臟及腸道的表達(dá)相對(duì)較高［5］。ClC通道家族成員的蛋白質(zhì)功能性結(jié)構(gòu)分析表明［6］，ClC通道蛋白質(zhì)可能形成二聚體，具有“雙筒槍（double－b－arreled）”通道結(jié)構(gòu)?；蛲蛔兯斐蒀lC型氯離子通道蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常，尤其是涉及功能的活性位點(diǎn)發(fā)生變化，是影響ClC型氯離子通道生理功能并發(fā)疾病的一個(gè)主要原因，例如CBS區(qū)域內(nèi)（真核生物ClC蛋白中還有兩個(gè)β－胱硫醚合酶）的點(diǎn)突變會(huì)影響通道的電壓依賴性及ATP結(jié)合，導(dǎo)致一些遺傳性疾?。?，8］，另外ClC型氯離子通道的基因缺陷或表達(dá)異常也會(huì)引起相應(yīng)的生理變化或疾病。

電壓門控性氯離子通道影響生物學(xué)行為的機(jī)制可能如下：（1）調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，運(yùn)用氯離子通道阻滯劑作用癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞周期停滯于G0／G1，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下降，這可能表明氯離子通道調(diào)節(jié)鈣離子濃度，從而間接影響癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期［9］。（2）磷酸化調(diào)節(jié)cAMP依賴的激酶（PKA）和蛋白激酶C（PKC），可以刺激或抑制ClC－2的活性，活體外的磷酸化測(cè)定顯示ClC－2可以被M時(shí)相特異同期蛋白依賴性激酶p34cdc2／細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白B（M－phase－specificcyclin－dependent kinase p34cdc2／cyclinB）磷 酸化［10］，顯著降低 ClC－2電流。因此 ClC－2第632位絲氨酸－丙氨酸（S632A）突變消除了ClC－2的磷酸化位點(diǎn)，從而消除了p34cdc2／cyclinB對(duì)其功能的調(diào)節(jié)作用。（3）細(xì)胞體積調(diào)控機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞處在一個(gè)低滲環(huán)境時(shí)，水的被動(dòng)流動(dòng)引起細(xì)胞腫脹后水和離子外流，細(xì)胞的體積得以恢復(fù)，此過程稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)性體積下降（regulatory volume decrease，RVD），癌細(xì)胞在侵襲遷移過程中需要體積下降以“擠”過狹小的組織間隙。調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮（RVD），認(rèn)為是當(dāng)細(xì)胞暴露與低滲環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膨脹，該膨脹會(huì)激活細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制，使已增大的細(xì)胞容積減小并向正常體積轉(zhuǎn)變。RVD被認(rèn)為是細(xì)胞增殖、分化、遷移及細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)的生理功能之一。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌發(fā)生中，氯通道通過RVD參與了細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［11，12］。Soroceanu等分別證實(shí)，氯通道阻斷劑能夠抑制腫瘤的侵襲。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)序貫，復(fù)雜的過程，包括腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶、黏附基底膜和細(xì)胞基質(zhì)，并對(duì)其水解破壞，癌細(xì)胞侵入周圍脈管，繼續(xù)生長形成轉(zhuǎn)移癌，貫穿于整個(gè)過程，肺癌細(xì)胞的浸潤可視為一個(gè)“主動(dòng)”運(yùn)動(dòng)過程，通過癌細(xì)胞容積和形狀的改變，具有浸潤潛能的癌細(xì)胞來完成浸潤及轉(zhuǎn)移。有研究證實(shí)低滲環(huán)境下，腺癌細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)容積的部分恢復(fù)，而鱗癌細(xì)胞可調(diào)節(jié)細(xì)胞回復(fù)原有的或甚至更小的容積，表明與正常肺組織相比，肺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的機(jī)制來控制細(xì)胞大小以保持其旺盛的生存能力，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生快速變形以增加其分裂增殖及浸潤潛能。

本實(shí)驗(yàn)采用RT－PCR法和 Western blot法分別在基因和蛋白水平檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌、肺良性病及正常肺組織中ClC－2mRNA及ClC－2通道蛋白的表達(dá)程度，結(jié)果顯示ClC－2基因產(chǎn)物為非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)量明顯高于肺良性病及正常肺組織，提示ClC－2可能與肺癌癌變的原始發(fā)生和進(jìn)展過程中起到基因調(diào)控作用，與腫瘤發(fā)生、促進(jìn)增長及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。ClC－2mRNA特異性表達(dá)升高在基因水平上賦予了肺癌細(xì)胞較強(qiáng)的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，有利于細(xì)胞大小和形狀的改變，從而導(dǎo)致瘤細(xì)胞易于分裂和侵襲轉(zhuǎn)移。然而蛋白表達(dá)水平上肺良、惡性腫瘤與正常肺組織相比有明顯表達(dá)增加，但良、惡性疾病之間無顯著差異。這可能提示氯通道作為電壓門控離子通道，廣泛分布于人體的細(xì)胞器及細(xì)胞器膜，調(diào)節(jié)細(xì)胞體積。在肺部疾病發(fā)展過程中正常細(xì)胞向疾病轉(zhuǎn)變，一系列遺傳信息的改變可能會(huì)影響ClC－2蛋白的表達(dá)，或ClC－2蛋白的活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致無論是非小細(xì)胞肺癌，還是肺良性疾病，均會(huì)增加ClC－2蛋白表達(dá)量。

但ClC－2mNRA及ClC－2蛋白在正常組織和肺部良、惡性疾病中的表達(dá)差異及發(fā)生變異的ClC－2離子通道基因作用于肺惡性腫瘤生成，進(jìn)展的哪個(gè)階段等一系列問題必將會(huì)今后研究的重要方向。ClC－2也將成為非小細(xì)胞肺癌及肺部疾病診的斷與治療提供新的基因靶位，對(duì)此，還需要進(jìn)一步研究。

［1］Jentsch TJ.CLC chloride channels and transporters from genes to protein structure，pathology and physiology［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2008，43（1）：3.

［2］Cheng G，Ramanathan A，Shao Z，et al.Chloride channel expression and functional diversity in the immune cells of allergic diseases［J］.CurrMolMed，2008，8（5）：401.

［3］Sontheimer H.An unexpected role for ion channels in brain tumormetastasis［J］.Exp Biol Med（Maywood），2008，233（7）：779.

［4］Kunzelmanm K Ion channels and cancer［J］.J Membr Biol，2005，205（3）：159.

［5］Jentsch TJ，Stein V，Weinreich F，et al.Molecular structure and physiological function of chloride channels.Physiol Rev，2002，82（2）：503.

［6］SCHMIDT－ROSE T，JENTSCH T J.Transminbrane topology of a CIC chloride channel［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（14）：7633.

［7］Zifarelli Getal.Intracellular regulation of human CIC－5by adenine nucleotides.EMBO，2009，10：1111.

［8］Meyer S et al.Nucleotide recognition by the cytoplasmic domain of the human chloride transporter CIC－5.Nat Struct Mol Biol，2007，14：60.

［9］LiM，Wang B，Lin W.Cl－channel blockers inhibit cell proliferation and arrest the cell cycle of human ovarian cancer cells［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2008，29（3）：267.

［10］T.FURUKAWA T，OGURA Y J，ZHENG H，et al.Phosphorylation and functional regulation of CIC－2chloride channels expressed in Xenopus oocytes by Mcyclin－dep－endent protein kinase［J］.J Physiol，2002，540：883.

［11］陳麗新，王立偉，Tin Jacob C l在鼻咽癌細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積回縮中的作用［J］.中國病理生理雜志，2002 18（5）：490.

［12］王立偉，陳麗新，朱林燕.抑制氯通道阻抑鼻咽癌細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖［J］.中國病理生理雜志，2004，20（5）：715.