金學(xué)洙，李超英，周 磊，邢美茜，劉鐵軍

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 肝病科，吉林 長(zhǎng)春130021）

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠原位肝癌模型，研究Bcl－2／Bax基因在化癥散積顆粒誘導(dǎo)小鼠原位肝癌發(fā)生凋亡過(guò)程中的作用與機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 IMDM培養(yǎng)基、新生牛血清購(gòu)自Gibco公司；TUNEL原位末端凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司；Tizol mRNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司；PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；Bcl－2和Bax抗體購(gòu)自Senta公司；引物合成由上海生工完成；化癥散積顆粒由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥物制劑研究室提供；陽(yáng)性藥物對(duì)照：復(fù)方斑蝥膠囊購(gòu)自貴州益佰制藥股份有限公司（批號(hào)：Z52020238）；鼠源性腹水型肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H22（吉林省腫瘤研究所提供）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，昆明種小白鼠，4－6周齡，體重22－25g，雌雄各半。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 鼠源性腹水型肝癌H22細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，經(jīng)小鼠腹腔傳代后備用。

1.3 小鼠原位肝癌模型的建立 取腹腔接種H22肝癌細(xì)胞株后7d的昆明種小鼠，無(wú)菌抽取H22肝癌細(xì)胞株腹水，生理鹽水洗滌，離心1 000r／min，5 min棄上清，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，生理鹽水調(diào)整癌細(xì)胞數(shù)至1×108／ml備用。健康昆明種小鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，小鼠仰臥固定，備皮，常規(guī)消毒鋪巾，于上腹正中劍突下作一約1cm的切口。輕壓雙側(cè)肋弓以擠出部分肝葉，濕紗布?jí)|于肝葉下方以保護(hù)，然后用0.25ml醫(yī)用注射器針頭沿肝葉長(zhǎng)軸方向插入緩慢注入H22肝癌細(xì)胞懸液0.03ml（細(xì)胞數(shù)為3×106）。在拔出針頭的同時(shí)，迅速用棉簽輕壓1min止血，然后在針眼周圍用酒精棉球輕搽。小心地將肝臟回納入腹腔，縫合切口術(shù)畢。術(shù)后正常飲水、進(jìn)食［3］。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 將瘤源小鼠分為5組，每組10只。實(shí)驗(yàn)分組如下：A.陽(yáng)性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱斑蝥組或FB）B.模型組（簡(jiǎn)稱mock）；C.低劑量治療組（簡(jiǎn)稱Low）；D.中劑量治療組（簡(jiǎn)稱 Medium）；E.高劑量治療組（簡(jiǎn)稱High）；化癥散積顆粒低、中、高用法為：1.95g／kg，3.9g／kg，7.8g／kg，灌胃1次／d，治療組連續(xù)14d，復(fù)方斑蝥膠囊用法為：0.19g／kg，灌胃1次／d，14次。模型組生理鹽水每天灌胃1次，連續(xù)14d，于末次給藥后24h，頸椎脫臼法處死小鼠，取腫瘤組織。

1.5 凋亡細(xì)胞的TUNEL檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書操作。熒光顯微鏡下成像，激發(fā)波長(zhǎng)為450－500 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515－565nm（綠色熒光）。按說(shuō)明書設(shè)立陰性對(duì)照。200倍視野下選取5個(gè)視野，計(jì)算并比較腫瘤組織原位細(xì)胞凋亡率。

1.6 RT－PCR 檢測(cè) Bcl－2和 Bax的 mRNA 表達(dá)給藥后取新鮮腫瘤組織，按照試劑盒說(shuō)明書提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用cDNA為模板，分別用Bcl－2、Bax和β－actin引物進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，30個(gè)循環(huán)后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以目的基因和內(nèi)參基因β－actin比值表示。各引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.7 Western－blot檢測(cè) Bcl－2、Bax的蛋白表達(dá)按試劑盒說(shuō)明書操作。DAB法顯色。膜采用天能凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行條帶吸光度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以目的蛋白和內(nèi)參蛋白β－actin比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL染色檢測(cè)晚期凋亡細(xì)胞 如圖1所示，在熒光顯微鏡下觀察肝癌組織原位的細(xì)胞凋亡情況，凋亡細(xì)胞被染成綠色，通過(guò)對(duì)5個(gè)不同視野的凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，F(xiàn)B、Medium和High組細(xì)胞凋亡率均明顯增加，與對(duì)照組相比具有明顯差異（P＜0.05，n＝5），而Low組雖然可以觀察到凋亡細(xì)胞但是其細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05，n＝5）。

圖1 熒光顯微鏡下的TUNEL染色結(jié)果（×200）和凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.2 RT－PCR檢測(cè)Bcl－2和Bax mRNA表達(dá) 如圖2所示，通過(guò)對(duì)以β－actin作為內(nèi)參校正后條帶進(jìn)行密度掃描分析，可以發(fā)現(xiàn)在斑蝥組、中劑量和高劑量組的腫瘤組織中的Bcl－2mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組（P＜0.05），Bax mRNA水平則明顯高于模型組（P＜0.05）；低劑量組Bcl－2和Bax mRNA水平與模型組相比稍高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 RT－PCR檢測(cè)不用給藥組腫瘤組織中Bcl－2和Bax的mRNA表達(dá)

2.3 Western－blot檢測(cè)Bcl－2和Bax蛋白表達(dá)

如圖3所示，腫瘤組織中的Bcl－2蛋白表達(dá)在FB、Medium和High組中表達(dá)明顯低于模型組和Low組（P＜0.05），Bax在FB、Medium和 High組中表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.05），Low組與模型組相比無(wú)明顯差異。通過(guò)上圖我們可以看出，Bcl－2／Bax蛋白表達(dá)的比值在不同組也有差異，其中FB、中劑量組和高劑量組比值明顯小于模型組（P＜0.05），而低劑量組比值與模型組無(wú)明顯差異（P＞0.05，n＝5）。

圖3 Western－blot檢測(cè)不同給藥組Bcl－2和Bax的蛋白表達(dá)

3 討論

細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下遵循自身的程序“自殺”，最后脫落離體或形成多個(gè)凋亡小體被其它細(xì)胞吞噬。誘導(dǎo)凋亡是目前藥物治療腫瘤的重要方向和方法。實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)TUNEL染色法檢測(cè)了不同給藥組和模型組的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組腫瘤細(xì)胞只發(fā)現(xiàn)很少凋亡細(xì)胞，而斑蝥組、中劑量組和高劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加，且對(duì)照組相比具有明顯差異（P＜0.05，n＝5），但是低劑量組凋亡細(xì)胞與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

Bcl－2家族蛋白是一組與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)蛋白，其產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜如線粒體膜、核周膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Bcl－2具有凋亡拮抗作用。Bax的細(xì)胞內(nèi)定位與Bcl－2類似，限于部分細(xì)胞核膜、線粒體外膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、胞漿。其作用與Bcl－2促細(xì)胞存活（抗凋亡）的作用相反，Bax基因可以促細(xì)胞發(fā)生凋亡［4，5］。生物學(xué)研究已經(jīng) 證實(shí) Bcl－2 與 Bax 在體內(nèi)形成同或異二聚體而發(fā)揮抗凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法定位檢測(cè)了Bcl－2和Bax在各組腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Bcl－2在模型組腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，低劑量組表達(dá)與模型組相比無(wú)明顯差異，而斑蝥組、中劑量和高劑量組腫瘤細(xì)胞中的Bcl－2則呈低表達(dá)；Bax表達(dá)情況與Bcl－2完全相反，在模型組和低劑量組中低表達(dá)，而在斑蝥組、中劑量以及高劑量組腫瘤細(xì)胞胞漿中高表達(dá)。同時(shí)我們通過(guò)RT－PCR的方法檢測(cè)了Bcl－2和Bax在mRNA水平即轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化，結(jié)果顯示通過(guò)對(duì)以β－actin作為內(nèi)參校正后條帶進(jìn)行密度掃描分析，可以發(fā)現(xiàn)的腫瘤組織中的Bcl－2mRNA水平在FB、Medium和High組明顯低于模型組（P＜0.05），Bax mRNA水平則明顯高于模型組；低劑量組Bcl－2和Bax mRNA水平與模型組相比稍高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Bcl－2與Bax mRNA和蛋白表達(dá)濃度的比值趨勢(shì)一致，斑蝥組、中劑量和高劑量組明顯低于模型組和低劑量組。結(jié)果說(shuō)明Bcl－2在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)減少，而Bax在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)增多，這種改變可能促進(jìn)細(xì)胞引發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)從原位肝癌小鼠給藥實(shí)驗(yàn)證明了，化癥散積顆?？梢种颇[瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在研究腫瘤生長(zhǎng)抑制機(jī)制的過(guò)程中，我們從細(xì)胞凋亡入手，探討了凋亡相關(guān)基因Bcl－2和Bax的表達(dá)改變，證明化癥散積顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)減少抑制凋亡基因Bcl－2表達(dá)，同時(shí)增加促凋亡基因Bax表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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