劉永林，陳能彬

（武警四川總隊醫(yī)院 燒傷整形外科，四川 樂山 614000）

前列腺素E2（PGE2）在燒傷后大鼠血管內(nèi)皮細胞分泌的機制研究

劉永林，陳能彬

（武警四川總隊醫(yī)院 燒傷整形外科，四川 樂山 614000）

目的 明確外周燒傷是否可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮細胞前列腺素E2增加及其發(fā)生機制。方法試驗大鼠（SD大鼠）接受約25%的全層（Ⅲ度）燒傷，并進行相關(guān)治療，在36小時后，對大鼠腦脊液進行采樣，測量其中的前列腺素E2（PGE2）含量，同時對大鼠腦和脊椎組織進行免疫組化研究，對其中與前列腺素合成有關(guān)的2種重要酶，環(huán)氧化酶2（COX-2）和微粒體前列腺E2合成酶（mPGES）進行分析。結(jié)果在燒傷后的大鼠腦脊液中，前列腺素E2的含量明顯增加，但可以被環(huán)氧化酶2的選擇性抑制劑NS398所抑制。在燒傷后，對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮細胞的免疫組化研究可以發(fā)現(xiàn)COX-2和mPGES。雙重免疫熒光法發(fā)現(xiàn)這2種酶主要集中在內(nèi)皮細胞的核周。結(jié)論外周的燒傷主要通過誘導中樞神經(jīng)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生COX-2和mPGES。這些酶可以提高腦脊液中的前列腺素E2濃度，從而激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)前列腺素E2的受體，產(chǎn)生燒傷后的全身癥狀。適當?shù)膽?yīng)用COX-2抑制劑，使燒傷患者的PGE2水平處在對機體有利的合適范圍內(nèi)，不僅可以減少患者的臨床的不適癥狀，以減輕燒傷早期損害和第二次打擊時機體失控的炎癥反應(yīng)，而且可以減少患者感染的發(fā)生率。

前列腺素E2；內(nèi)皮細胞；炎癥

（ChinJLabDiagn，2012，16：0036）

外周神經(jīng)系統(tǒng)的燒傷，通常會伴有全身的炎癥反應(yīng)，比如說發(fā)燒、神經(jīng)過敏、厭食癥等等，這些反應(yīng)可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變有關(guān)。過度的反應(yīng)會不同程度的降底患者的生活質(zhì)量、提高并發(fā)癥和死亡率的發(fā)生［1］。因此對與中樞神經(jīng)系統(tǒng)在燒傷后的反應(yīng)機制研究，可以人為的控制這些過度反應(yīng)，減少其負作用，有重要的臨床價值。但就目前來說，對燒傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化研究甚少。我們發(fā)現(xiàn)燒傷后全身性的反應(yīng)，從某種程度上講與感染后的反應(yīng)相似［2］，比如說發(fā)熱、食欲下降等等。從這種現(xiàn)象說明了這2種病可能有相同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機制改變。目前已經(jīng)知道在全身性的感染疾病中，前列腺素E2（PGE2）可引起發(fā)熱等全身不適反應(yīng)。因此我們推測在燒傷后同樣也存在這種變化。在感染的動物模型中，中樞系統(tǒng)中的前列腺素E2的作用已經(jīng)有詳細研究。比如說在大鼠腹腔內(nèi)注射細菌的脂多糖可引起腦脊液中的前列腺素E2增加，發(fā)熱等現(xiàn)象。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)和免疫組化也發(fā)現(xiàn)細菌的脂多糖可以誘導大腦上皮細胞產(chǎn)生環(huán)氧化酶2（COX-2）和微粒體前列腺 E2合成酶（mPGES）［3，4］。由此，我們推測，燒傷可誘導大腦產(chǎn)生COX-2和mPGES，從而使腦脊液中的PGE2含量增加，這是全身性炎癥反應(yīng)發(fā)生的一個基礎(chǔ)，為了驗證這一點，我們建立了大鼠的燒傷模型，測定了其腦脊液中的PGE2含量，并通過免疫組化的方法，觀察了內(nèi)皮細胞中COX-2和mPGES的表達。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠（180－220g）24只，隨機分為2組，試驗組和對照組，各12只，主要試劑：1%的磺胺嘧啶銀軟膏，酶免疫分析法試劑盒（（Cayman Chemical，Ann Arbor，MI），NS398（Cayman Chemical），環(huán)氧化酶2（COX-2）的多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA），兔抗鼠COX-2多克隆抗體（Cayman Chemical），羊抗鼠von Willebrand因子多克隆抗體，異硫氰酸鹽標記的第2抗體（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA），Cy3標記的第2抗體（Jackson ImmunoResearch），所用的試驗大鼠在試驗前與恒溫恒濕的飼養(yǎng)室自由進食一天。

1.2 燒 傷 模 型 的 建 立［5，6］大 鼠 以 戊 巴 比 妥 鈉（40mg／kg）進行腹腔內(nèi)注射麻醉后，將大鼠的背部浸入85℃熱水中10s，腹部浸入6s，造成3度燒傷，面積約25%，磺胺嘧啶銀軟膏用于燒傷皮膚表面，以防止感染，對照組的大鼠以溫水浸泡，其余處理同試驗組。在36h后，再次將大鼠麻醉，提取腦脊液和腦、脊髓組織，其中腦脊液標本由小腦延髓池中取出，保存于－80℃的液氮中，腦和脊髓組織標本保存于干冰中（－40℃），對于部分大鼠在提取腦脊液2h前，于腹腔內(nèi)注射選擇性的COX-2抑制劑，NS398（5 mg／kg），腦脊液中的PGE2使用乙酸乙酯進行提取，然后用酶聯(lián)免疫分析進行定量分析。

1.3 免疫組化冰凍的腦組織和脊髓標本，切成16μm的組織切片（溫度為－20℃），用對應(yīng)的抗體對COX-2和mPGES進行染色，第1抗體由異硫氰酸熒光素標記，第2抗體由Cy3進行標記，細胞核的DNA由TOTO-3進行染色（黑），檢測儀器的熒光測量波長如下（nm），異硫氰酸熒光素（488 515±30），Cy3（54 590±70），TOTO-3（637），熒光圖像由共聚焦顯微鏡進行觀察（BioRad Radiance 2000）。

1.4 統(tǒng)計方法所有的數(shù)值以平均值±標準差記錄，2組數(shù)據(jù)的比較采用 Mann-Whitney檢驗，多組之間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05為有顯著差別。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠脊腦液中PGE2的濃度和COX-2抑制因子的效果（圖1a）燒傷組大鼠腦脊液中PGE2的濃度明顯高于對照組，在注射了COX-2的選擇性抑制因子NS398（5mg／kg）后PGE2的濃度明顯下降，而注射對照劑（不含NS398的氯化鈉溶液）則無效，對照組大鼠對COX-2則無反應(yīng)（圖1b）。結(jié)果說明：COX-2可提高大鼠腦脊液中PGE2的含量。

圖1 2組大鼠脫離腦脊液PGE2的濃度和COX-2抑制因子的效果

2.2 免疫組化結(jié)果通過免疫組化的方法，我們檢測了PGE2二種合成酶的位置（COX-2、mPGES），由圖2我們可以看出，試驗組大鼠的腦和脊髓血管內(nèi)皮細胞對COX-2抗體（兔抗鼠、羊抗鼠、人抗鼠）均呈陽性反應(yīng)（圖2a1、2b1），但對照組大鼠血管內(nèi)皮細胞均無反應(yīng)（圖2a2、2b2），同樣對試驗組大鼠的血管內(nèi)皮細胞對mPGES也呈陽性反應(yīng)，而對照組為陰性（圖2c1，2c2）。

圖2 COX-2和mPGES在內(nèi)皮細胞的表達

2.3 對COX-2呈陽性反應(yīng)的小血管內(nèi)皮細胞通過三重熒光染色法可進一步證實（圖3a1）。vW因子（血管內(nèi)皮標記物 圖3a2），細胞核的DNA染色（圖3a3），這些從共聚光學顯微鏡獲得的圖像顯示，COX-2主要表達在內(nèi)皮細胞核周圍。因為vW因子是內(nèi)皮細胞中特有的一種小囊泡，故對vW的免疫染色也為陽性。說明COX-2主要在細胞核周表達。進一步測定PGE2的合成酶的位置，mPGES和COX-2，如圖所示（3b1-b3，3c1-c3），對 mPGES（紅色）和COX-2（綠色）免疫反應(yīng)陽性的細胞區(qū)域是重疊的（核周）。

3 討論

本研究說明外周的燒傷可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦脊液）中的PGE2濃度的升高，PGE2是一種可引起發(fā)熱、痛覺過敏和炎癥性疾病的中樞遞質(zhì)，因此我們可以認為，燒傷后PGE2升高是燒傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種反應(yīng)。由于PGE2的濃度升高可以被COX-2的選擇性抑制劑所抑制，所以這種效應(yīng)是由COX-2所引起的，研究發(fā)現(xiàn)燒傷后的發(fā)熱可以被吲哚美辛栓（一種非選擇性的COX-2抑制劑）抑制［7，8］。

通過研究，我們發(fā)現(xiàn)大腦血管內(nèi)皮細胞是燒傷后產(chǎn)生PGE2的來源，燒傷后可引起內(nèi)皮細胞核周同時產(chǎn)生COX-2和mPGES，這2種是在功能上有密切關(guān)聯(lián)的酶［9］。實事上，Murakami也發(fā)現(xiàn)了，如果將COX-2和mPGES基因轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的細胞中，則可以產(chǎn)生低濃度的PGE2。PGE2合成的第1步是細胞膜磷分解生成花生四烯酸，在這一過程中起關(guān)鍵作用的可能是2種酶，細胞溶質(zhì)磷脂酶A2和促分泌型磷脂酶A2，這2種酶在燒傷后的患者，特別是合并有感染的患者中濃度明顯升高，但它們的具體作用強弱還有待進一步的研究［10－12］。因為燒傷后PGE2在血液中的濃度明顯升高，因此血液可能是燒傷后腦脊液PGE2升高的另一個因素，但是由于大部分前列腺素，包括PGE2在每1次循環(huán)通過肺部時，超過90%的前列腺素被氧化酶氧化失活，半衰期極短，僅有30秒。所以前列腺素在動脈血的濃度應(yīng)該遠低于靜脈血，而且即使動脈血中的PGE2明顯升高，由于其電離分子為負離子形式，也無法通過血腦屏障［13，14］。因此中樞神經(jīng)系統(tǒng)的PGE2是通過外周血液進入的可能性是非常小的。

COX-2和mPGES的產(chǎn)生機制：在燒傷后中樞神經(jīng)血管內(nèi)皮細胞的COX-2和PGES的產(chǎn)生過程中，促炎癥因子起了重要的作用，在燒傷后，促炎癥因子，包括：IL-1a，IL-1β，腫瘤壞死因子（TNF），這些因子可激發(fā)細胞內(nèi)的信號傳導途徑［15］，激活COX-2和mPGES的轉(zhuǎn)錄基因，通過外周注射TNF也可以使腦血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生COX-2，其中炎癥介質(zhì)IL-6單獨不能引起COX-2和mPGES升高，但可以提高IL-1的熱效應(yīng)，所以它是產(chǎn)生炎癥效應(yīng)的一個重要的輸助因子［16，17］。

目前的發(fā)現(xiàn)有重要的臨床意義。長期以來，非類固醇類的抗炎藥物一直用于燒傷后的患者，以減輕他們的疼痛和發(fā)熱，但是其機理和作用部位一直不明確，通過研究發(fā)現(xiàn)，對腦血管內(nèi)皮細胞COX－2的抑制作用是這類藥物的靶點之一，這為應(yīng)用選擇性的COX-2抑制劑來治療燒傷后的患者所產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)過度反應(yīng)提供了理論依據(jù)。同時研究還發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（含脊髓）在燒傷后可產(chǎn)生COX-2，說明燒傷后的痛覺過敏、發(fā)熱這些炎癥反應(yīng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)機制有關(guān)［18］。

另外一個重要的問題是，感染是燒傷患者死亡的主要原因之一。感染的發(fā)生主要與燒傷后皮膚屏障功能破壞及機體免疫功能低下有關(guān)。大多數(shù)學者認為，燒傷后PGE2水平的升高是燒傷后機體免疫功能低下的主要原因之一。因此中樞性的PGE2升高也可以產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，導致細菌感染的發(fā)生率上升［19］，目前的免疫學研究已經(jīng)證實，PGE2不僅可以直接抑制白細胞、淋巴細胞和巨噬細胞，而且可以介導全面的免疫抑制效應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的PGE2可以激活腦垂體－腎上腺軸的反射，其最終產(chǎn)物是糖皮質(zhì)激素，也是一種免疫抑制激素，因此，對于燒傷后的患者適當?shù)膽?yīng)用COX-2抑制劑，使燒傷患者的PGE2水平處在對機體有利的合適范圍內(nèi)，不僅可以減少患者的臨床的不適癥狀，以減輕燒傷早期損害和第二次打擊時機體失控的炎癥反應(yīng)，而且可以減少患者感染的發(fā)生率。這是值得探索的一條途徑。

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Burn injury enhances brain prostaglandin E2production through induction of cyclooxygenase2and microsomal prostaglan- din E synthase in cerebral vascular endothelial cells in rats

LIUYong-lin，CHENNeng-bin.（SichuanProvincialCorps HospitalCAPF，Leshan614000，China）

ObjectiveMethods To examine whether peripheral burn injury in rats elevates prostaglandin EZ in the central nervous system and to determine where in the central nervous system enzymes responBible for prostaglandin E2 synthesis are expressed.Subjects：Sprague-Dawley rats.Interventions：Rats

either approximately 25%fullthickness burn injury or sham treatment.At 36hrs after the injury，the cerebrospinal fluid was sampled to measure prostaglandin E2，and the brain and the spinal cord were sampled for immunohistochemical detection of cyclooxygenase-2and microsomal-type prostaglandin E2synthase，enzymes that are responsible for prostaglandin E2production.Measurements and Main.ResultsThe prostaglandin E2concentration in the cerebrospinal fluid was significantly elevated in the injured rats，and this elevation was suppressed by a cyclo-oxygenase-2-specific inhibitor，NS398.Only in the injured rats，cyclooxygenase-2and microsomal-type prostaglandin E synthase proteins were detected in vascular endothelial cells throughout the central nervous system with no regional difference.A double-immunofluorescence study revealed that cyclooxygenase-2and microsomal-type prostaglandin E synthase were coexpressed in the perinuclear region of the endothelial cells.ConclusionThese results indicate that peripheral burn injury induces cyclooxygenase-2and microsomal-type prostaglandin E synthase in endothelial cells of the central nervous system.These enzymes likely elevate the cerebrospinal fluid concentration of prostaglandin E2，aprostanoid that，in turn，activates prostaglandin E2receptors on the central nervous system neurons involved in the general symptoms following burn injury.

prostaglandin E2；endothelial cells；inflammation；

R644

A

1007－4287（2012）01－0036－04

2011－03－12）