李 帆，張馨木，崔常雷，韓樹(shù)海＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院）

rhKD／APP在腎缺血再灌注損傷大鼠炎性反應(yīng)平衡中的器官保護(hù)作用

李 帆1，張馨木2，崔常雷1，韓樹(shù)海1＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院）

＊通訊作者

牛胰蛋白酶抑制劑（Bovine pancreatic trypsin inhibitor，BPTI）作為Kunitz屬絲氨酸蛋白酶抑制劑的典型代表，是目前研究的最廣泛的蛋白酶抑制劑家族之一，被廣泛的應(yīng)用于臨床器官保護(hù)。但由于其異源蛋白的局限性限制了其臨床應(yīng)用。重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑rhKD／APP與BPTI有42%的同源性，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其具有光譜的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性［1］。我研究小組已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了rh－KD／APP對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用［2］，本試驗(yàn)研究其在大鼠腎缺血再灌注損傷過(guò)程中對(duì)于組織過(guò)氧化物酶（MPO）、腫瘤壞死因子（TNF-a）和核因子（NF-κB）的影響，探討rhKD／APP在腎缺血再灌注炎癥損傷中的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料健康雄性Wistar大鼠60只，體重250g－300g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為6組（n＝10）：Ⅰ組為偽手術(shù)組；Ⅱ組為腎I／R模型組，夾閉大鼠雙腎腎蒂，制備腎臟缺血再灌注模型［3］；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別為rhKD／APP小、中、大劑量組，腎I／R＋ 尾靜脈注射rhKD／APP 1、2 、4萬(wàn)KIU／kg（吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所生化室提供）；Ⅵ組為為依那普利組（對(duì)照組），腎I／R＋尾靜脈注射依那普利0.134mg／kg（江蘇省常州制藥廠有限公司）。Ⅰ、Ⅱ組大鼠于造模前24小時(shí)，模型建立后即刻，模型建立后24小時(shí)尾靜脈注射生理鹽水，Ⅲ－Ⅴ組大鼠于上述各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)尾靜脈注射小、中、大劑量的rhKD／APP，Ⅵ組（對(duì)照組）大鼠于上述各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)尾靜脈注射依那普利。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法再灌注48小時(shí)給藥后，自腹主動(dòng)脈取血3－4ml，離心（2 500rpm）10min，取血清0.1 ml，ELISA法測(cè)定TNF-a（上海森雄科技實(shí)業(yè)公司腫瘤壞死因子測(cè)定試劑盒）。取腎組織與MPO測(cè)定試劑盒（南京建成生物公司）提供的勻漿介質(zhì)，按腎重將腎組織制成5%組織勻漿液，測(cè)量腎組織MPO值。另取腎臟組織多聚甲醛液中固定，制備石蠟塊。使用核因子免疫組化試劑盒（武漢博士德生物公司）測(cè)定核因子，利用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)，分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)N1，總細(xì)胞數(shù)N；同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度（F）判斷：淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，最終的陽(yáng)性積分＝N1／N＊F。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，計(jì)量指標(biāo)兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhKD／APP對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織MPO、血清TNF-a的影響

模型組MPO、TNF-a活性較偽手術(shù)組顯著增高；大劑量組MPO、TNF-a活性較模型組顯著降低（P＜0.01），大劑量組對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織MPO、TNF-a活性的影響優(yōu)于對(duì)照組；中劑量和小劑量組腎組織MPO、TNF-a活性較模型組有明顯降低（P＜0.05），與對(duì)照組表現(xiàn)相近。

表1 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組MPO、TNF-a活性（±s，n＝10）

表1 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組MPO、TNF-a活性（±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 TNF-a（U／L） MPO（U／L）偽手術(shù)組 8.53±2.3＊＊ 16.53±7.3＊＊模型組 41.72±17.8 34.12±15.8小劑量組 12.67±14.9＊＊ 29.63±16.7＊中劑量組 8.02±14.8＊ 28.82±15.8＊大劑量組 5.73±15.7＊ 25.48±8.9＊＊對(duì)照組 7.57±16.3＊ 28.57±15.3＊

2.2 rhKD／APP對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織核因子（NF-κB）表達(dá)的影響

模型組腎組織核因子表達(dá)較偽手術(shù)組顯著增多（P＜0.01）；小劑量組、中劑量組、大劑量組腎組織核因子表達(dá)均較模型組顯著下調(diào)（P＜0.01），與對(duì)照組作用相近。

表2 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組腎組織核因子（NF-κB）表達(dá)（±s，n＝10）

表2 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組腎組織核因子（NF-κB）表達(dá)（±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 NF-κB偽手術(shù)組 1.27±0.88＊＊模型組 6.0±1.46小劑量組 3.61±0.82＊＊中劑量組 3.49±0.69＊＊大劑量組 3.21±0.74＊＊對(duì)照組 2.93±0.86＊＊

3 討論

腎缺血再灌注有關(guān)的炎癥反應(yīng)在IRI損傷中起著非常重要的作用，其中細(xì)胞因子在其發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。缺血和再灌注早期產(chǎn)生的黏附分子和細(xì)胞因子構(gòu)成了缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)［4，5］。再灌注時(shí)中性粒細(xì)胞在缺血區(qū)血管內(nèi)聚集，同時(shí)伴有血管內(nèi)皮腫脹、血小板淤積阻塞微血管，形成無(wú)復(fù)流現(xiàn)象（no reflow phenom inon）。且中性粒細(xì)胞激活時(shí)產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、氧自由基，均參與腎臟組織損傷。腎缺血再灌注損傷可能從多種途徑啟動(dòng)了炎癥信號(hào)，激發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)擴(kuò)大效應(yīng)的進(jìn)一步損傷，包括組織損傷誘導(dǎo)的炎癥、應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥、氧自由基損傷誘導(dǎo)的炎癥以及炎癥細(xì)胞的自身激活與正反饋等途徑。

MPO是炎癥反應(yīng)中活化的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞分泌的一種過(guò)氧化物酶。MPO是中性粒細(xì)胞聚集的特征酶，通過(guò)對(duì)MPO活性的測(cè)定可較明確地反應(yīng)中性粒細(xì)胞聚集的程度。炎癥反應(yīng)急性期大量釋放的MPO通過(guò)催化氧化產(chǎn)物的大量生成，破壞一氧化氮的調(diào)節(jié)作用，將炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙內(nèi)在鏈接，形成一個(gè)惡性循環(huán)。rhKD／APP可以通過(guò)抑制人體多種以絲氨酸為活性中心的酶來(lái)發(fā)揮其抑炎功效。

NF-κB是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一組蛋白質(zhì)家族，它們是細(xì)胞內(nèi)最重要的活性蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它調(diào)控大量基因的轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、黏附因子、凋亡調(diào)控因子、炎癥通路蛋白、細(xì)胞應(yīng)激蛋白等，是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，大量炎性蛋白質(zhì)的表達(dá)是細(xì)胞損傷和修復(fù)過(guò)程中最重要的分子生物學(xué)事件［6］。在缺血再灌注損傷超早期，應(yīng)激、活性氧和炎癥誘導(dǎo)了NF－κB的活化和相應(yīng)炎癥因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；而隨之發(fā)生的細(xì)胞凋亡反饋激活了NF－κB的凋亡拮抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，因此腎缺血再灌注損傷NF－κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果是各種細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄的凈結(jié)果。絲氨酸蛋白酶抑制劑rhKD／APP能夠特異性拮抗NF－κB絲氨酸蛋白酶依賴(lài)的炎癥信號(hào)，卻不影響NF－κB的酪氨酸蛋白酶依賴(lài)的凋亡拮抗信號(hào)，因此，絲氨酸蛋白酶抑制劑在NF－κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，從兩個(gè)途徑即抗炎和抗凋亡途徑，發(fā)揮腎缺血再灌注損傷的器官保護(hù)［7］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠腎臟MPO、血清TNF-a活性均顯著降低，這說(shuō)明rhKD／APP抑制了炎癥反應(yīng)的中性粒細(xì)胞的活化及炎性因子的釋放。同時(shí)rhKD／APP各個(gè)劑量組的核因子（NF-κB）的表達(dá)均明顯降低，說(shuō)明rhKD／APP通過(guò)抑制NF－κB的過(guò)度表達(dá)發(fā)揮了抗炎作用。提示rhKD／APP可能是通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞黏附、聚集、浸潤(rùn)，降低細(xì)胞因子、黏附分子的表達(dá)、抑制NF-κB的過(guò)度表達(dá)，阻止或減輕了炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，從而對(duì)腎缺血再灌注大鼠發(fā)揮器官保護(hù)作用。同時(shí)rhKD／APP作為人源蛋白較BPTI具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

［1］White TD，Deborah L，David，D.et al.United States Patent，2003，6：613.

［2］韓樹(shù)海，崔常雷，張馨木，等.rhKD／APP對(duì)腎臟缺血在灌注損傷大鼠的腎保護(hù)作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2008，12（9）：1105.

［3］李廣宇，周南，王利民，等.小鼠急性缺血－再灌注腎損傷模型的建立及體會(huì)［J］.嶺南現(xiàn)代臨床外科，2005，5（4）：308.

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1007－4287（2012）01－0034－02

2010－09－26）