趙繼學，王廣義，張海玉＊，伏 鑫

（吉林大學1.第一醫(yī)院a.兒外科；b.普外科，吉林 長春130021；2.中日聯(lián)誼醫(yī)院）

骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干細胞（HSCs）外的另一類干細胞。由于其來源充足，取材相對方便，易于體外擴增，以及免疫原性低等優(yōu)勢，已經(jīng)在組織工程和移植領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。本實驗旨在建立一種分離、培養(yǎng)、純化及鑒定MSCs的方法，并對其生物學特性進行研究，為后續(xù)利用骨髓MSCs治療肝臟疾病的研究提供穩(wěn)定的干細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級昆明小鼠，雌雄兼用，體重25±2g，購自吉林大學實驗動物中心［合格證號：SCXK（吉）2003－0001］；DMEM 培養(yǎng)基（美國GibcoBRL公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；淋巴細胞分離液（上海恒信公司），0.25%胰蛋白酶（華美公司），兔抗鼠CD34、CD44熒光抗體（美國PHARMINGEN公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSCs的體外分離、培養(yǎng)及擴增 斷頸處死小鼠，超凈臺上取脛骨和股骨，切開兩端松質(zhì)骨，并在骨干中部剪斷，無血清DMEM-LG培養(yǎng)基沖出骨髓細胞，制成單細胞懸液，經(jīng)Percoll密度梯度離心法，分離和收集有核細胞，用含15%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基重懸離心管中的MSCs，鏡下細胞計數(shù)，使細胞密度達到1×106個／ml，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，換液，將MSCs不斷純化。當細胞生長融合達80%－90%時，用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散細胞，在顯微鏡下控制消化時間，計數(shù)細胞，以1∶3密度擴增培養(yǎng)。此時標記為P1代，以后每3－4d換液1次；當細胞生長融合達80%－90%時，繼續(xù)以1∶3的密度傳代擴增培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)并記為P2代，余類推。倒置相差顯微鏡逐日觀察細胞形態(tài)和生長情況。

1.2.2 骨髓MSCs生長曲線的繪制 取對數(shù)生長期的P1、P2、P3代 MSCs以1.0×105／ml密度分別接種在96孔培養(yǎng)板中，每3孔為一組，每孔100μl。分別在接種后的第1d、2d、3d、4d、5d、6d，以MTT法測細胞活力。每孔加入MTT溶液（5g／l）10μl，混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液。每孔加入100μl DMSO溶液，振蕩，鏡下觀察結(jié)晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔在490nm波長處的光吸收值，每組取3孔測定值的平均值。以天數(shù)為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.3 骨髓MSCs的細胞周期分析 取生長狀態(tài)良好的P3代細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，采用流式細胞儀直接熒光法檢測細胞周期。其中激發(fā)光源為15mW氬離子激光，波長488nm。FACS軟件收集細胞，Lysis軟件分析處理數(shù)據(jù)，記錄陽性細胞百分率。

1.2.4 骨髓MSCs表面抗原檢測 取生長狀態(tài)良好的 P3代小鼠骨髓 MSCs，用1：1的 EDTA（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）混合液進行消化，離心后棄去培養(yǎng)基。PBS洗滌后制成濃度為1×106／ml的單細胞懸液。在3個管中各加100μl細胞懸液，并標記為1，2，3號。在1、2號管中分別加入兔抗鼠 CD34-FITC 10μl，CD44-FITC 10μl，3管中加入抗人IG-FITC 10μl，3管為陰性對照。室溫孵育30min，流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 昆明小鼠骨髓MSCs的基本形態(tài)

新分離的MSCs呈小圓形，形態(tài)規(guī)整。MSCs傳代培養(yǎng)的細胞大小均勻，形態(tài)較一致，多為梭形，此時細胞不再以成克隆的方式生長，而是散在分布生長。MSCs連續(xù)傳3代，細胞形態(tài)無明顯變化，無衰老征象，傳代周期6－7d。表明MSCs得到了進一步的純化及擴增。P3代后的MSCs能較好的用于后期實驗。

2.2 骨髓MSCs生長曲線測定

由MTT法測定小鼠P1、P2、P3代各個時間點骨髓MSCs活率，繪制的生長曲線呈S型（見圖1），由圖可見，MSCs在接種后第1－2d為潛伏期，隨后便快速增殖，進入對數(shù)生長期，持續(xù)2－3d，此后細胞增長逐漸減緩，進入平臺期。P3代的MSCs能較好的用于后期實驗。

2.3 骨髓MSCs細胞周期分析結(jié)果

取生長良好的三代細胞，采用流式細胞儀直接熒光法，檢測細胞周期，記錄陽性細胞百分率，見圖2。由圖可見，75.27%的細胞處于 G0－G1期，表明MSCs具有強大的分化增殖能力。

2.4 骨髓MSCs表面抗原的表達

流式細胞儀檢測顯示P3代小鼠骨髓MSCs強表達CD44，表達率為88.71%，基本不表達造血細胞表面標志CD34。（見圖3）。

3 討論

骨髓MSCs是具有多向分化潛能和高度自我更新能力的組織干細胞。研究證實骨髓MSCs不僅可以分化為與其組織來源一致的細胞，而且具有跨系或跨胚層分化為不同組織來源細胞的潛能。但骨髓中 MSCs的數(shù)量極少，僅占0.001%－0.01%［1］，要利用MSCs就必須對其進行體外分離、擴增。

現(xiàn)體外分離得到均一的骨髓MSCs的方法逐漸成熟，而通過體外擴增獲得足夠數(shù)量的間充質(zhì)干細胞己實現(xiàn)。分離骨髓MSCs的方法主要有四種：貼壁篩選法［2］、密度梯度離心法［3］、免疫磁珠分離法［4］、流式分選法［5］等。后兩種方法是目前獲得MSCs純度最高的方法，然而該方法操作復雜、費用及設(shè)備要求較高。在分離中對細胞活性有一定影響。

圖1 MSCs生長曲線

圖2 MSCs細胞周期

圖3 MSCs表面抗原的表達 A：CD34，B：CD44

我們使用密度梯度離心和貼壁篩選相結(jié)合，利用Percoll（1.073g／ml）分離液將大部分造血細胞與單個核細胞分離開來，并經(jīng)過體外貼壁培養(yǎng)一段時間，通過換液去除懸浮生長的造血細胞，獲得較理想的骨髓MSCs。

我們用生長曲線來描述骨髓MSCs的生長繁殖能力，骨髓MSCs生長曲線分潛伏適應(yīng)期、對數(shù)生長期和平臺期。發(fā)現(xiàn)昆明小鼠P1、P2、P3代骨髓MSCs的生長曲線均呈S型。骨髓MSCs的生長性狀穩(wěn)定，P1、P2、P3代細胞的形態(tài)、生長曲線無明顯差別，潛伏適應(yīng)期1－2d，對數(shù)生長期2－3d，傳代周期約6－7d。MSCs具有無限增殖的能力，但前提是必須具備MSCs體外生長的最佳環(huán)境。目前公認MSCs的培養(yǎng)必須用FBS做支持［6］，合適的血清濃度對細胞的生長具有關(guān)鍵性的作用。血清中含有多種營養(yǎng)成分，對細胞的生長起著重要作用，但培養(yǎng)基中血清的濃度并非越高越好。張怡等［7］實驗證實，血清濃度＜10%不利于細胞生長；10%－15%時，細胞增殖旺盛，形態(tài)均一；當血清濃度＞15%時，易引起骨髓MSCs分化而影響增殖。本實驗采用15%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓MSCs，細胞增值速度快，表形均一，得到了理想的傳代細胞。

MSCs的表型不均一，分別具有間充質(zhì)細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞的特點。所以過去一直沒有發(fā)現(xiàn)MSCs特異性的表面標志物。一般認為，MSCs對SH2、SH3、CD29、CD44、CD77、CD90、CD106、CD120a、CD124等都呈陽性反應(yīng)，對CD1a、CD31、CD34、CD14、CD45、CD56等成陰性反應(yīng)［8，9］。大多數(shù)實驗室通過MSCs不表達CD14、CD34及CD45，而表達CD44、CD90、CD106等標志，對 MSCs進行初步鑒定。目前尚未發(fā)現(xiàn)MSCs特異性標記分子，可聯(lián)合應(yīng)用多種抗體幫助分離鑒定MSCs。

本實驗中利用密度梯度離心法結(jié)合MSCs貼壁生長的特性，從成年昆明小鼠骨髓中分離、擴增培養(yǎng)獲得形態(tài)均一的細胞集落。流式細胞儀檢測結(jié)果提示75.27%的細胞處于G0－G1期，表明 MSCs具有強大的分化增殖能力。分離培養(yǎng)的骨髓MSCs強表達CD44，而造血譜系標記CD34基本不表達，說明所分離的細胞是有別于骨髓HSCs的MSCs，培養(yǎng)的P3代細胞均一性較好。

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