李 莉，李 慶，喬路新，丁 渭，呂福東

（首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069）

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是一種硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparansulfate proteoglycan，HSPG），通過磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上［1，2］。其開放讀碼框為1 740bp，編碼580個氨基酸的蛋白質(zhì)前體。由于GPC3在肝細胞癌（HCC）中特異性高表達，而在正常肝或癌旁肝組織中不表達，可以作為肝細胞癌的臨床診斷標志物，因此國內(nèi)外學者對此進行了廣泛研究［3－5］。目前認為GPC3可通過激活經(jīng)典Wnt信號通路促進肝癌細胞的生長［6］，但具體機制仍然不清。本研究通過構(gòu)建GPC3基因的真核表達載體，為研究GPC3在肝癌中的作用機制提供有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料表達載體pcDNA4.1、E.coliJM109菌株、E.coliDH5α菌株、人類肝臟cDNA文庫由本實驗室保存，HLE人肝癌細胞株由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室趙曉航教授饋贈，兔抗人GPC3多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，質(zhì)粒抽提純化試劑盒和膠回收試劑盒為北京博邁德科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，高保真DNA polymerase、DNA分子量標準、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ）、pMD-18simple T vector為 TaKaRa 公司產(chǎn)品，其他生化試劑：溴化乙啶（EB）、氨芐霉素、瓊脂糖、乙醇、PBS等均為國產(chǎn)分析純或進口分裝試劑。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 GPC3基因的獲得根據(jù)GenBank中查找的GPC3開放讀碼框（1 740bp）自行設(shè)計GPC3上、下游引物，并導入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點，序列如下：上游5′-CCG GGA TCC ATG GCC GGG ACC GTG CGC-3′（下劃線處為 BamHⅠ酶切位點），下游5′-CCG GAA TTC TCA GTG CAC CAG GAA GAA G-3’（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點），以人類肝臟cDNA文庫為模板進行PCR擴增目的基因，PCR擴增反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2min，72℃10min。擴增產(chǎn)物長度大小為1 740bp。取5μl反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分析。應(yīng)用DNA片段快速純化回收試劑盒回收目的片段，與pMD-18simple T vector進行連接，轉(zhuǎn)化入E.coli DH 5α中，進行克隆。經(jīng)籃白斑篩選，挑取白斑單克隆進行搖菌，并送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。

1.3 pcDNA-GPC3真核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將上述T載體產(chǎn)物和真核表達載體pcDNA4.1用BamHⅠ、EcoRⅠ分別酶切，電泳線性片段并予以切膠回收GPC3片段和酶切后的真核表達載體pcDNA并純化。用T4DNA連接酶連接pcDNA載體片段與GPC3基因片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細菌，鋪Amp＋LB平板，隨機挑取克隆菌落并提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定pcDNA-GPC3重組質(zhì)粒。

1.4 重組質(zhì)粒再次測序鑒定測序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成，以確定重組質(zhì)粒內(nèi)的目的片段序列正確。

1.5 pcDNA-GPC3轉(zhuǎn)染HLE細胞將消毒、高壓后的18nm×18mm的蓋玻片置于6孔板中，將處于對數(shù)生長期的HLE人肝癌細胞胰酶消化收集，以4×105／孔接種于六孔細胞培養(yǎng)板，每孔加完全培養(yǎng)基10%FBS-MEM 2ml，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞達80%鋪滿。用LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒pcDNA-GPC3轉(zhuǎn)入HLE細胞。

1.6 熒光顯微鏡檢測重組質(zhì)粒pcDNA-GPC3轉(zhuǎn)入HLE細胞48h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌標本3次，每次2min；4%多聚甲醛溶液固定標本10min；PBS洗滌標本3次，每次2min；1%Triton-100室溫孵育20min；PBS洗滌標本3次，每次2min；1%正常羊血清封閉1h，去除多余封閉液；一抗（GPC3抗兔多克隆抗體1∶500稀釋）孵育，4℃過夜；PBS洗滌標本3次，每次2min；滴加二抗FITC（1∶500稀釋），室溫孵育1h；PBS洗滌標本3次，每次2min；用含有DAPI的甘油封片，鏡檢，拍照；設(shè)立陰性對照，以正常兔血清代替一抗，其余步驟相同。

2 結(jié)果

2.1 GPC3cDNA的PCR擴增以人類肝臟cDNA文庫為模板，用自行設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見一條特異性區(qū)帶，位于1500－2000bp之間，與預(yù)期大?。? 740 bp）相符（圖1）。

2.2 T載體和真核表達載體pcDNA-GPC3的酶切鑒定挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，可見1 740bp的插入片段，提示重組質(zhì)粒含有GPC3基因編碼區(qū)全長（圖2）。

2.3 GPC3在pMD-18simple T vector和在真核表達載體中的序列測定分別采用通用引物正向測序、反向測序及設(shè)計引物反向測序，測序結(jié)果證明插入片段讀框和方向正確。核酸測定結(jié)果：目的片段為1 740bp，經(jīng)與GeneBank中的序列進行比較，與Genbank ID：NG-009286.1的匹配率為99%，DNA序列中發(fā)生突變的位點為：1355T→C。DNA所編碼的氨基酸序列含有580個氨基酸殘基，經(jīng)比對未發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基的突變。

2.4 熒光顯微鏡檢測結(jié)果由圖3可見與不表達GPC3的HLE細胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-GPC3質(zhì)粒的HLE細胞，可見明顯的GPC3的表達。實驗組細胞的綠色熒光主要表達于細胞膜上和細胞漿中，而未轉(zhuǎn)染的HLE細胞和陰性對照未見明顯的綠色熒光。說明我們成功的構(gòu)建了可以表達GPC3蛋白的pcDNA-GPC3質(zhì)粒。

圖1 GPC3基因PCR擴增目的片段的瓊脂糖凝膠電泳圖圖2 重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定 圖3 轉(zhuǎn)染pcDNA－GPC3質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染pcDNA4.1空載體的HLE細胞對比。可見與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HLE細胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA－GPC3質(zhì)粒的HLE細胞有明顯的GPC3的表達。

3 討論

自從1997年Hsu等［7］首先報道GPC3mRNA在HCC組織中高表達。隨后越來越多的學者發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中，不管是GPC3mRNA還是蛋白均呈過表達，并在 HCC的早期即已發(fā)生［8］。不少學者研究顯示GPC3在HCC中具有很高的敏感性和特異性。Shirakawa等［9］用免疫組化的方法檢測107例 HCC，GPC3陽性者87例（81.3%）。Llovet等［10］報道，在丙型肝炎后肝硬化背景的早期肝癌組織中（＜2cm的肝癌結(jié)節(jié)）GPC3表達率100%，其他良性肝病和正常肝組織中表達率為0。Shirakawa等比較了HCC和ICC（肝內(nèi)膽管癌）組織中GPC3表達情況，發(fā)現(xiàn)HCC表達率78.3%，而ICC無表達。并且原發(fā)性肝癌患者血清中AFP及GPC3蛋白表達水平之間不具有相關(guān)性，因此聯(lián)合檢測AFP及GPC3可以提高原發(fā)性肝癌患者診斷的特異性和敏感性，特別是對小原發(fā)性肝癌及AFP陰性原發(fā)性肝癌患者具有重要的診斷意義。而且研究發(fā)現(xiàn)高分化HCC較中分化及低分化HCC的GPC3表達少，GPC3陽性患者的5年生存率較陰性者低，提示其表達水平與原發(fā)性肝癌的臨床分期、病理分級有關(guān)，對預(yù)測腫瘤的惡性程度及預(yù)后具有重要價值［11］。Ligato等用ELISA法研究腺瘤、局灶性結(jié)節(jié)性增生、原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性腫瘤中GPC3的表達水平，發(fā)現(xiàn)GPC3在原發(fā)性肝癌的診斷敏感性為83.3%，特異性為96%，而其他類型的腫瘤和增生中均呈陰性，提示GPC3是一個區(qū)別原發(fā)性肝癌與其它良惡性肝腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的高度敏感的腫瘤標志物［12］?，F(xiàn)在，GPC3已被廣泛用于 HCC的病理鑒別診斷，包括原發(fā)性HCC和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移癌的鑒別、高分化HCC與腺瘤及不典型增生的鑒別。

盡管大量研究證實GPC3蛋白在肝癌組織中高表達，而在非癌組織中沒有表達或表達極少，但在正常情況下，GPC3對生長起負性調(diào)控作用，其表達缺失，導致過度生長及畸形綜合征（simpson-golabibehmel syndrome，SGBS）。目前，對GPC3刺激肝癌生長的作用機制不清。存在著通過經(jīng)典Wnt信號途 徑［5，13］、FGF2、IGF2 信 號 途 徑［14，15］等 幾 種 理論，但具體機制仍然不明。為了更好的研究GPC3在肝癌中發(fā)生和發(fā)展中的作用機制，本實驗構(gòu)建完成真核表達重組質(zhì)粒pcDNA-GPC3，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實GPC3序列和方向的正確性。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GPC3不表達的HLE人肝癌細胞后，經(jīng)熒光顯微鏡檢測，結(jié)果表明目的基因已經(jīng)成功在真核細胞中成功表達，為我們下一步的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

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