羅小華

（福建省連城縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，福建 連成 366200）

本文用當?shù)伉唸龇蛛x的鴨疫里默氏菌株制備自家苗，對防治鴨傳染性漿膜炎的效果進行了探討和研究，旨在為實際生產(chǎn)作指導。

1 細菌分離與鑒定

1.1 分離培養(yǎng) 選擇剛死亡且具有典型鴨傳染性漿膜炎病變的病死鴨，無菌采集肝組織，將采集的病料剁碎，除去結締組織和筋膜后稱重，加適量生理鹽水，用消毒好的組織勻漿機絞3～5min至勻漿狀。由于搗碎機高速運轉，溫度上升很快，尤其是夏天溫度高時，容器中的病料很容易變質而破壞病原的免疫原性，故夏天制苗時，在搗碎機中加入病料和生理鹽水時要用冷卻水冷卻。對于新采取的病料需反復凍融三次，將解凍的病料與生理鹽水按1kg：3500～4000mL的比例進行稀釋，再用雙層無菌醫(yī)用紗布過濾，然后將濾液先后過一次八層和十二層的紗布。再取樣分別接種于普通培養(yǎng)基、馬丁肉湯、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，分別作純培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)觀察 將分離的10株細菌在馬丁肉湯中（37℃）作、24h純培養(yǎng)，再分別用革蘭氏染色和瑞氏染色進行鑒定。

1.3 生化試驗 分離菌經(jīng)純化后，用其48h馬丁肉湯培養(yǎng)物進行生化反應測定，置37℃燭缸中觀察15 d。

1.4 血清學鑒定 將分離細菌接種在葡萄糖淀粉瓊脂平皿上培養(yǎng)24h，然后將每個平皿上的細菌懸浮于8.5%氯化鈉（質量百分比）、0.02mol/L磷酸鹽、0.3%福爾馬林（體積百分比）溶液中（pH=7.0，1mL），再在100℃水浴鍋上加熱1 h，然后1 500 r/min離心30min，取上清液，與1型鴨疫里默氏桿菌標準陽性血清進行平板凝集試驗和瓊脂擴散試驗。

1.5 藥敏試驗 在巧克力瓊脂平板上采用藥敏片擴散法進行。在含5%～10%CO2的環(huán)境中37℃下培養(yǎng)24 h觀察，然后對照標準判斷結果。

1.6 動物發(fā)病實驗 取10只健康雛鴨作動物實驗，皮下注射培養(yǎng)菌液后觀察雛鴨有無發(fā)病癥狀。

2 分離鑒定結果

2.1 分離培養(yǎng) 將病料接種于巧克力瓊脂平板上，經(jīng)37℃厭氧培養(yǎng)48h后，長出了灰白色、半透明、微凸起的圓形菌落；在馬丁肉湯中呈現(xiàn)均勻混濁狀態(tài)；置于燭缸中的麥康凱瓊脂平板上未見有細菌生長；在37℃恒溫培養(yǎng)的麥康凱平板上培養(yǎng)3d后，亦無細菌生長；普通瓊脂平板上同樣無細菌生長。

2.2 形態(tài)觀察 分離的10株細菌經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，均為革蘭氏陰性小桿菌；經(jīng)瑞氏染色法染色鏡檢，可見7株細菌呈兩極濃染，符合鴨疫里默氏桿菌的染色特性。

2.3 生化試驗 糖發(fā)酵試驗：對甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖均不發(fā)酵；不還原硝酸鹽，MR試驗、VP試驗均為陰性；過氧化氫酶試驗呈陽性。以上反應均符合鴨疫里默氏桿菌的生化特性。

2.4 血清學鑒定 凝集試驗和瓊脂擴散試驗證實，與1型鴨疫里默氏桿菌標準陽性血清發(fā)生陽性反應，說明7株瑞氏染色陽性細菌株均為鴨疫里默氏桿菌血清1型。

2.5 藥敏試驗 分離菌對氟甲砜霉素、甲哌利福霉素、氨芐青霉素、先鋒霉素、林可霉素高度敏感；對青霉素、呋喃唑酮和氯霉素中高度敏感；對慶大霉素、新霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素不敏感。

2.6 動物發(fā)病實驗 試驗鴨接種病料后48h，雛鴨相繼發(fā)病，眼、鼻流出漿液性分泌物。糞便稀薄呈綠色，嗜眠、縮頸或嘴抵地面，腿軟弱，不愿走動；瀕死前出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如痙攣、搖頭、點頭，背脖和兩腿伸張呈角弓反張。剖檢病死鴨，最明顯的病變是心包腔內及肝表面有一層纖維素性滲出物；心外膜、氣囊壁混濁增厚，腹腔積水，有的脾臟腫大，表面有灰白色斑點。取典型病死鴨病料用瑞氏法染色，發(fā)現(xiàn)菌體兩端濃染，呈兩極染色特性。

通過以上分離鑒定，確定從可疑鴨疫里默氏桿菌病鴨中分離的菌株為鴨疫里默氏桿菌。

3 自家苗的制備與檢測

3.1 增菌培養(yǎng) 將純培養(yǎng)物接種于馬丁肉湯培養(yǎng)液，37℃振搖培養(yǎng)24h，取少量菌液作細菌計數(shù)，使?jié)舛冗_1010個/mL。

3.2 甲醛滅活 加入體積百分比為0.4%的甲醛溶液，置37℃下滅活48h，滅活期間，每4～6h搖動一次，搖動時間約為半小時。滅活完畢后，按1500 IU/mL比例加入雙抗（青霉素和鏈霉素），還要加一定量的黃芪多糖，以增加抗體的生成。搖勻后進行無菌分裝，置4℃下保存待用。

3.3 無菌檢驗 取滅活后的菌液接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，如果無任何細菌生長說明甲醛滅活完全，無菌檢驗合格；反之則自家苗制備失敗。

3.4 安全性檢驗 取10只健康雛鴨，頸部皮下注射1mL菌液，連續(xù)觀察14 d，如果雛鴨無外觀癥狀，也無病理變化，則表示自家苗安全。

3.5 效力檢驗 取20只健康雛鴨，其中只對10只雛鴨注射疫苗：將疫苗回溫且徹底搖勻后于頸部皮下或肌肉注射（0.2mL/只），另外10只作為對照組。注射前要對注射針具徹底消毒，注射時要勤換針頭。注射完疫苗后，有的鴨群略顯安靜，采食飲水略有下降，這均屬正常的機體反應，一般1～2d即可完全恢復。14d后對兩組雛鴨分別注射未滅活的鴨疫里默氏桿菌，然后進行細致觀察。分開飼養(yǎng)，以免交叉感染。共分4個批次進行效力檢驗試驗，每次均分為試驗組和對照組兩組，免疫程序和劑量均相同。

4 自家苗的制備與檢測結果

4.1 純培養(yǎng)物作增菌培養(yǎng) 在馬丁肉湯培養(yǎng)液中經(jīng)37℃振搖培養(yǎng)24 h后，取少量菌液作細菌計數(shù)，結果細菌濃度達了3.2×1010個/mL。

4.2 無菌檢驗 經(jīng)普通營養(yǎng)瓊脂平板37℃培養(yǎng)24 h后，無任何細菌生長，說明甲醛滅活完全，無菌檢驗合格。

4.3 安全性檢驗 連續(xù)觀察14d后，雛鴨無外觀癥狀，剖檢也未發(fā)現(xiàn)病理變化，說明粗制疫苗菌液是安全的。

4.4 效力檢驗 經(jīng)觀察，對照組雛鴨過夜后即有發(fā)病者出現(xiàn)，病初表現(xiàn)為眼流漿液性或黏性分泌物，常使眼周圍羽毛粘連或脫落；鼻孔流出漿液或黏液性分泌物，有時分泌物干涸，堵塞鼻孔；有輕度咳嗽和打噴嚏；糞便稀薄呈綠色或黃綠色；嗜睡，縮頸或嘴抵地面，腿軟，不愿走動、步態(tài)蹣跚；瀕死前出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如痙攣、背脖和兩腿伸直呈角弓反張狀，尾部搖擺等，不久抽搐而死，病程一般2～3d。經(jīng)剖檢證實為注射的鴨疫里默氏桿菌所引起，而試驗組（接種疫苗組）連續(xù)觀察14 d后，無病例出現(xiàn)。說明所制自家疫苗對鴨疫里默氏桿菌病有保護作用。

經(jīng)過對4批共計80只雛鴨的防治試驗表明：使用以上方法制備的自家苗對鴨傳染性漿膜炎有明顯的防治效果。在鴨群發(fā)病時，使用疫苗1周后發(fā)病明顯減少，10～15 d病癥狀完全消除，未見復發(fā)情況。同時，用自家苗對未發(fā)病鴨群免疫接種也能起到良好的預防效果，未見該病發(fā)生。

5 結論

筆者用自制的疫苗對發(fā)生鴨漿膜炎的鴨群進行緊急注射能很快控制疫情；對未發(fā)病的鴨群提前注射又 起到了有效預防控制的作用。因此該自家苗是防治鴨傳染性漿膜炎的一種有效疫苗。

雖然自家苗具有免疫防治作用，但由于它屬于生物性產(chǎn)品，所以要絕對注意其生物安全性。首先，目前沒有什么辦法去測定自定苗中具體的病原含量，這是一種運用實踐來檢驗效果與質量的治療方法。其次，自家苗本身就是滅活苗，無論細菌還是病毒等大多已經(jīng)被殺死，而且采集的有可能是幾種病混合感染的病料，所以病料成分及結構更加復雜，產(chǎn)生抗原的蛋白質種類也多。最后，雖然自家苗可以用，但是前提是發(fā)病比較厲害的情況下采用，不要動輒就用自家苗，那樣風險會很大。

[1]張國紅，王澤民.鴨傳染性漿膜炎的診斷及其控制[J].當代畜牧，2000，（4）：15-16.

[2]趙文翰.鴨疫巴氏桿菌病[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2005，（8）：46-47.

[3]王艷明.鴨傳染性漿膜炎的診斷與防治[J].畜牧與飼料科學，2009.

[4]陳寬維，江宵兵，章雙杰，等.連城白鴨資源特性[J].保護及開發(fā)方向，2003，25（9）.

[5]徐友文，張福潮.我國養(yǎng)鴨業(yè)現(xiàn)狀和實施鴨無公害養(yǎng)殖的宏觀措施[J].湖南畜牧獸醫(yī)，2007.

[6]蔡秀磊，韋 強，崔言順，等.浙江省22株鴨疫里默氏桿菌的血清型鑒定及耐藥性研究 [J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2007，19（1）：46-49.

[7]汪銘書，程安春，陳孝躍，等.血清8型鴨疫里默氏桿菌在我國的發(fā)現(xiàn)及其病原特性研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2003，25（1）：47-52.

[8]康昭風，肖海紅，劉林秀，等.鴨疫巴氏桿菌防制研究[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2004，16（3）：31-34.

[9]程安春，汪銘書.鴨疫巴氏桿菌的分離和鑒定[J].四川畜牧獸醫(yī)，1996，（2）：7-9.