柳丹丹，肖 發(fā)，楊曉麗，李玫璐，曾艷軍，于張穎，沈立榮，*，裘 衛(wèi)，尹志紅

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058;2.杭州碧于天保健品有限公司，浙江杭州311500)

蜜蜂蜂王不同于工蜂的關(guān)鍵因素-蜂王漿主蛋白1

柳丹丹1，肖 發(fā)1，楊曉麗1，李玫璐1，曾艷軍1，于張穎1，沈立榮1，*，裘 衛(wèi)2，尹志紅2

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058;2.杭州碧于天保健品有限公司，浙江杭州311500)

蜂王漿是決定蜜蜂幼蟲發(fā)育中級(jí)型分化，即成為蜂王還是工蜂的關(guān)鍵環(huán)境因素，而蜂王漿主蛋白(main royal jelly proteins，MRJPs)是反映蜂王漿新鮮度的重要指標(biāo)。日本鐮倉(cāng)昌樹以蜜蜂和果蠅為模型的最新研究表明，MRJP1是蜂王漿中決定蜜蜂級(jí)型分化的關(guān)鍵因子，該蛋白可通過(guò)激活蟲體脂肪體中的表皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，引發(fā)個(gè)體增大、發(fā)育時(shí)間縮短和卵巢發(fā)育等蜂王特征的出現(xiàn)。因此，今后很有必要進(jìn)一步開展MRJP1對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)功能和作用機(jī)理研究，為MRJP1應(yīng)用于功能食品提供科學(xué)依據(jù)。

蜜蜂，蜂王漿，蜂王漿主蛋白1(MRJP1)，級(jí)型分化

Abstract:The royal jelly(RJ)is the critical environment factors of caste determination，becoming worker or queen in development for honeybee larvae.Main royal jelly proteins(MRJPs)are the important quality index revealed RJ fresh level.According to Kamakura’s new discovery with honey bee and Drosophila as models，MRJP1 was the critical factors of caste determination in honeybee.The appearance of the characters of queen，such as increasing of body weight，decreasing of developmental time and ovary development appeared were caused by activating an epidermal growth factor receptor(Egfr)signaling pathway in fat body.Therefore，it was essential to further study the nutritional functions and mechanism of MRJP1 in human in future，which will provide knowledge for the protein to be applied in functional foods.

Key words:honeybee(Apis mellifera);royal jelly;main royal jelly protein 1(MRJP1);cast differentiation

級(jí)型是指在社會(huì)性昆蟲群體中，同一性別具有不同的形態(tài)、身體結(jié)構(gòu)、職能和行為的個(gè)體類型。蜜蜂有三個(gè)級(jí)型:雄蜂、蜂王和工蜂。雄蜂為單倍體，由未受精卵發(fā)育而來(lái);蜂王和工蜂都是由受精卵發(fā)育而成，遺傳基因完全相同，但由于發(fā)育環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)的差異而產(chǎn)生不同級(jí)型的分化，使兩者在形態(tài)、生理、行為等方面有明顯差異［1-2］。不同的營(yíng)養(yǎng)條件或差異性飼喂是引發(fā)蜂王和工蜂幼蟲發(fā)育命運(yùn)根本改變的基礎(chǔ)，其中蜂王漿(royal jelly)是蜜蜂級(jí)型分化的關(guān)鍵，且可能含有一種決定級(jí)型分化的特別因子，但這種特別因子以前尚未鑒定;此外，蜂王漿對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的作用機(jī)理也不清楚［2-3］。日本富山縣立大學(xué)鐮倉(cāng)昌樹的最新研究發(fā)現(xiàn):royalactin，即蜂王漿主蛋白 MRJP1(main royal jelly protein 1，MRJP1)是蜜蜂級(jí)型分化的決定性因子［3］。本文結(jié)合相關(guān)背景和文獻(xiàn)就此作一專題介紹和述評(píng)。

1 蜂王漿對(duì)蜜蜂的主要生理功能

蜂王漿是蜂群中5～15日齡期哺育工蜂的咽下腺、上顎腺和腦后腺等腺體的分泌物，是決定蜜蜂幼蟲發(fā)育過(guò)程中級(jí)型分化的關(guān)鍵環(huán)境因素，其生理功能主要表現(xiàn)在三個(gè)方面:

第一，決定個(gè)體的級(jí)型分化和發(fā)育速度。哺育蜂能夠區(qū)分兩種不同的巢房，給予幼蟲不同質(zhì)和量的食物。王臺(tái)容積比工蜂房要大得多，王臺(tái)內(nèi)的幼蟲被連續(xù)飼以過(guò)量王漿，整個(gè)幼蟲期間都以王漿為食，且被飼喂次數(shù)比工蜂幼蟲多10倍以上，因此發(fā)育快、蛹期短，從卵到羽化只用16d時(shí)間，比工蜂少5d，其生殖系統(tǒng)及相應(yīng)的器官發(fā)育充分，羽化后成為蜂王;而工蜂房?jī)?nèi)的幼蟲孵化后3d內(nèi)吃的是成分與王漿不相同的工蜂漿，之后取食的主要是蜂蜜和花粉的混合物，漿量少，因此工蜂幼蟲比王臺(tái)內(nèi)的幼蟲生長(zhǎng)慢，其幼蟲期延長(zhǎng)到6d，蛹期延長(zhǎng)到12d，到21d后方羽化為成蟲，其個(gè)體發(fā)育周期比蜂王多了5d。這說(shuō)明幼蟲食物的質(zhì)和量對(duì)級(jí)型分化有決定性作用，而且是以其特定的培養(yǎng)環(huán)境為基礎(chǔ)的［1］。據(jù)劉光楠等最新觀察，1只蜂王幼蟲在生長(zhǎng)發(fā)育期平均消耗196.8mg蜂王幼蟲食物，比工蜂幼蟲的食物消耗量增加41.2%(1只工蜂幼蟲在生長(zhǎng)發(fā)育期平均消耗139.4mg 工蜂幼蟲食物)［4］。

第二，決定個(gè)體的壽命和生殖機(jī)能，使蜂王具有較長(zhǎng)的壽命和旺盛的生殖能力。蜂王的壽命一般有1年以上，最長(zhǎng)的達(dá)8年;而工蜂在生產(chǎn)季節(jié)只能存活50d左右，即使在半冬眠的越冬期最多也只能活11個(gè)月，蜂王壽命是工蜂的10～30倍。在繁殖季節(jié)，蜂王可不停地產(chǎn)卵，最盛時(shí)1d可下2000粒卵，卵的總重量相當(dāng)于蜂王的體重，而工蜂則不具生殖功能［5-6］。

第三，決定個(gè)體的外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)。如工蜂有蠟腺而蜂王沒(méi)有，蜂王的上顎腺分泌物能抑制工蜂的卵巢發(fā)育，而工蜂上顎腺的主要功能是分泌報(bào)警信息素等。蜂王卵巢發(fā)育完全，而工蜂卵巢發(fā)育不全，只有無(wú)功能的受精囊和交配囊，其個(gè)體也比蜂王小約50%，羽化時(shí)體重比蜂王的輕得多。二者后足分化明顯，工蜂擁有花粉籃結(jié)構(gòu)，蜂王則無(wú)［7］。

蜂王和工蜂的遺傳基因完全相同，但由于發(fā)育環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)的差異而產(chǎn)生不同級(jí)型的分化，它們的發(fā)育進(jìn)度、體型、壽命和生殖力就出現(xiàn)如此巨大的差異，使人們感到非常神秘，促使科學(xué)家們樂(lè)此不疲地進(jìn)行長(zhǎng)期研究和探索;并推測(cè)蜂王漿可能對(duì)人類也具有營(yíng)養(yǎng)和生理調(diào)節(jié)功能，進(jìn)行了蜂王漿作為藥品、功能食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和化妝品的研究開發(fā)［8］。

2 對(duì)蜂王漿中關(guān)鍵活性成分的認(rèn)識(shí)

顯然，蜂王漿的功能源于所含生物活性成分。已知蜂王漿含水分60%～70%、蛋白質(zhì)12%～15%、碳水化合物10%～16%、脂類3%～6%、10-羥基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA，王漿酸)1.4%～2.0%以及類固醇激素、維生素、游離氨基酸等［7］，王漿酸是蜂王漿特有的活性成分。蛋白質(zhì)約占蜂王漿干物質(zhì)的50%，由水溶性蛋白和非水溶性蛋白組成，水溶性蛋白占總蛋白含量的46%～89%，為王漿蛋白的主要部分，稱為主要王漿蛋白(major royal jelly proteins，MRJPs)。MRJPs約占水溶性王漿蛋白的 90%［8-9］。

近十年多來(lái)，蜂王漿中的活性蛋白和多肽成為研究熱點(diǎn)。2006年10月西方蜜蜂(Apis mellifera)基因組分析結(jié)果公布，該研究的九項(xiàng)成就之一就是確定MRJPs是一個(gè)分子量范圍在25～87ku的家族-MRJP/Yellow protein family，該家族擁有9個(gè)成員(MRJP1～MRJP9)［10］。MRJPs 家族來(lái)自于在果蠅中發(fā)現(xiàn)的同一個(gè)祖先Yellow-e3蛋白，各成員間具有高度的序列同源性，同時(shí)也具備一些相同的結(jié)構(gòu):均有四個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，序列中存在一些幾乎完全相同的氨基酸區(qū)域，C末端均具有高度疏水的特征性結(jié)構(gòu)［11］。MRJPs包含大量必需氨基酸，在蜜蜂營(yíng)養(yǎng)中具有重要作用。其中分子量為57ku的MRJP1是王漿蛋白中含量最豐富的糖蛋白，占MRJPs的48%。已知西方蜜蜂MRJP1 cDNA的編碼序列為1430bp，編碼的蛋白含432個(gè)氨基酸殘基的蛋白，蛋白的N端含有一個(gè)由19個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，含有 Asn28、Asn144、Asn177這 3 個(gè)糖基化位點(diǎn)。MRJP1蛋白含有20%的α螺旋和β折疊［10-12］。

MRJP1在王漿中以三種形式存在:單體、寡聚體以及和脂肪酸交互作用后形成的水不溶性的聚合體。MRJP1單體大小約為47ku，一般以與Apisimin結(jié)合的形式存在［13］，Apisimin 大小約為 5.5ku，是 54個(gè)氨基酸的小肽［14-15］。最早報(bào)道的MRJP1寡聚體是Apisin，其大小為350ku，它具有刺激人單核細(xì)胞增殖的活性［16］。目前已確定，MRJP1糖蛋白的聚合體是分子量為420ku的apalbumin-1，該名詞的取名是考慮到MRJP1的性質(zhì)類似于白蛋白albumin，再加上蜜蜂的縮寫ap。Apalbumin-1和小肽apisimin(5.5 ku)的低聚體組成分子量為450ku的聚合蛋白。Simuth等已用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察到了apalbumin-1的中MRJP1聚合體的顯微結(jié)構(gòu)［18-19］。MRJP1在蜂王漿中以分子量為57ku的單體糖蛋白存在，它的結(jié)構(gòu)不同于apalbumin-1，能識(shí)別MRJP1的多克隆抗體不能識(shí)別 apalbumin-1，表明 MRJP1不可能由apalbumin-1衍生而來(lái)，為此，鐮倉(cāng)昌樹將MRJP1命名 為 royalactin(royaljelly derived，hepatocyteactivating protein)［3］。

各國(guó)學(xué)者對(duì)MRJP1的功能和特性作了一系列研究。鐮倉(cāng)昌樹等針對(duì)鮮王漿能使小鼠運(yùn)動(dòng)后改善生理疲勞的功能，進(jìn)行了組分與功能關(guān)系分析。他們發(fā)現(xiàn)，在40℃下貯存了7d的蜂王漿無(wú)抗疲勞功能，經(jīng)檢測(cè)證實(shí)蜂王漿中的MRJP1被降解，而維生素、王漿酸和其他脂肪酸含量均未發(fā)生改變，從而推測(cè)蜂王漿對(duì)小鼠的抗疲勞作用與其新鮮度，即MRJP-1的含量有關(guān)［20-22］。隨后，他們?cè)贛RJP-1對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞的生理影響研究中發(fā)現(xiàn)，在無(wú)血清培養(yǎng)基中，MRJP1蛋白能顯著刺激肝細(xì)胞的DNA合成和白蛋白的產(chǎn)生，顯示促進(jìn)細(xì)胞分裂因子活性，其促細(xì)胞分裂活力具有劑量效應(yīng)，濃度越高活力越強(qiáng)［23-24］。Majtan等發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中重組表達(dá)的MRJPl具有促進(jìn)鼠吞噬細(xì)胞釋放腫瘤細(xì)胞壞死因子TNFα，提高肝細(xì)胞的增殖作用;在有充足血清的媒介中能刺激人淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)［25］。Yamaguchi等通過(guò)王漿酸、粗蛋白、MRJP1與蜜蜂幼蟲生長(zhǎng)關(guān)系觀察，發(fā)現(xiàn)MRJP1是促進(jìn)幼蟲生長(zhǎng)的關(guān)鍵蛋白，且兩者呈劑量依賴關(guān)系，因此他們?cè)?008年第九屆亞洲養(yǎng)蜂大會(huì)上建議將MRJP1作為蜂王漿質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)［26］。目前捷克學(xué)者已開發(fā)出用MRJP1多克隆抗體ELISA快速檢測(cè)蜂王漿質(zhì)量的方法［27］。

3 MRJP1是促使蜜蜂級(jí)型分化的關(guān)鍵因素的最新發(fā)現(xiàn)

3.1 MRJP1對(duì)蜜蜂級(jí)型分化和果蠅發(fā)育的作用

鐮倉(cāng)昌樹以鮮蜂王漿和經(jīng)40℃貯存7、14、21和30d的蜂王漿分別喂養(yǎng)蜜蜂幼蟲，結(jié)果只有鮮蜂王漿喂養(yǎng)的蜜蜂幼蟲發(fā)育成為蜂王，其余經(jīng)貯藏的蜂王漿會(huì)減慢幼蟲的生長(zhǎng)速度，使新羽化的成蟲體重減輕、卵巢體積縮小、預(yù)蛹發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)，且這些參數(shù)與蜂王漿的貯存時(shí)間成正比。經(jīng)40℃貯存30d的蜂王漿飼養(yǎng)的雌蜂發(fā)育成為工蜂。然后，他將蜂王漿在4℃和40℃分別貯存30d，再分別測(cè)定樣品中維生素、王漿酸、碳水化合物和脂肪酸含量。結(jié)果顯示，在40℃條件下貯存30d的蜂王漿中泛酸含量減少了60%，而其他成分無(wú)顯著性變化。但泛酸對(duì)蜜蜂幼蟲發(fā)育為蜂王并無(wú)影響［28］。然后用HPLC和非變性丙烯酰胺凝膠電泳分析40℃條件下貯存30d的蜂王漿中蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分子量為 450(即apalbumin-1與Apisimin的聚合體)、170和57ku(即MRJP1)的蛋白在貯藏過(guò)程中被降解了。170ku的蛋白40℃貯藏14d就完全分解，但此時(shí)的蜂王漿仍然能夠影響卵巢和幼蟲生長(zhǎng)，故判定170ku蛋白與蜜蜂級(jí)型分化無(wú)關(guān)。MRJP1在40℃貯藏過(guò)程中逐步被分解，在30d時(shí)全部被降解，而apalbumin-1在30d時(shí)只有10%被降解。再測(cè)定apalbumin-1，MRJP1對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的影響，和對(duì)照酪蛋白相比較，用40℃貯存30d的蜂王漿喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組最終發(fā)育出的蜜蜂的個(gè)體大小、發(fā)育時(shí)間以及卵巢大小沒(méi)有改變。但是在40℃貯存30d的蜂王漿中加入MRJP1能夠縮短蜜蜂的發(fā)育時(shí)間，并增加新羽化的蜜蜂成蟲的體重和卵巢體積，且加入的MRJP1越多，增大的趨勢(shì)越明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度為2%時(shí)能與蜂王漿同樣，可誘使蜜蜂四齡幼蟲發(fā)育成為蜂王。最后，采用大腸桿菌表達(dá)的重組MRJP1(分子量為47ku的E-royalactin)喂養(yǎng)蜜蜂幼蟲，出現(xiàn)了類似鮮王漿的結(jié)果。而用apalbumin-1和酪蛋白喂養(yǎng)的蜜蜂幼蟲沒(méi)有產(chǎn)生這種效果。以上結(jié)果顯示，MRJP1對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的影響不僅是營(yíng)養(yǎng)上的，也是形態(tài)上的，MRJP1是蜂王漿中誘導(dǎo)蜜蜂發(fā)生級(jí)型分化的主要功能因子。

用含20%蜂王漿、8%酵母和10%D-葡萄糖的飼料飼喂果蠅(Drosophila melanogaster)，在攝入能量相等的前提下，與對(duì)照飼料或加入酪蛋白的飼料相比，添加蜂王漿組果蠅的個(gè)體增大(包括體重以及體長(zhǎng))，繁殖能力增強(qiáng)，壽命延長(zhǎng)，發(fā)育時(shí)間縮短。同時(shí)，與用40℃貯存30d蜂王漿喂養(yǎng)的果蠅相比，用MRJP1飼喂果蠅能增加個(gè)體大小、增大細(xì)胞體積、增強(qiáng)繁殖能力，延長(zhǎng)壽命并縮短發(fā)育時(shí)間，而這些形態(tài)上的變化在用450ku蛋白和酪蛋白飼養(yǎng)時(shí)觀察不到，上述結(jié)果與用MRJP1誘導(dǎo)蜜蜂幼蟲發(fā)育成為蜂王的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這說(shuō)明該蛋白對(duì)生物特征的影響是跨物種的［3］。

3.2 MRJP1對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的作用機(jī)理

由于蜂王漿對(duì)果蠅表現(xiàn)出類似于蜜蜂的功能，鐮倉(cāng)昌樹測(cè)定了蜂王漿對(duì)果蠅的胰島素受體(insulin receptor，InR)突 變 體 (InRE19/InRE19和 InRp5545/InRE19)、前胸腺和側(cè)咽體上攜帶有P0206-Gal4基因的1-磷脂酰肌醇3-激酶高活性突變體、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，Egfr)突變體(Egfrtsla/Egfrf24)個(gè)體大小的影響。結(jié)果相對(duì)于空白或者加入酪蛋白的飼料組，用含蜂王漿的飼料飼喂的InR突變體和P0206＞dPI3K突變體，能增大體型和縮短發(fā)育時(shí)間，但對(duì)Egfr突變體果蠅的個(gè)體大小與發(fā)育時(shí)間無(wú)影響。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用蜂王漿或者M(jìn)RJP1喂養(yǎng)果蠅產(chǎn)生的體重增加和發(fā)育時(shí)間縮短現(xiàn)象與脂肪體中的Egfr信號(hào)通路有關(guān):通過(guò)脂肪體中的表皮生長(zhǎng)因子受體激活控制身體個(gè)體增大的p70S6激酶(p70S6 kinases，p70S6K)，通過(guò)增大細(xì)胞大小增大果蠅體型;通過(guò)脂肪體中的Egfr促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activation protein kinases，MAPK)，激活脂肪體中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路來(lái)縮短果蠅發(fā)育時(shí)間。轉(zhuǎn)基因果蠅實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)MRJP1能活化幼蟲脂肪體內(nèi)的MAPK、S6K，而這種激活作用能被果蠅Egfr RNAi抑制，轉(zhuǎn)基因果蠅由于Egfr信號(hào)通路受阻，導(dǎo)致體型與細(xì)胞大小的增加、發(fā)育時(shí)間縮短被抑制，結(jié)果與用蜂王漿喂養(yǎng)果蠅的效果一致［3］。

為研究MRJP1誘導(dǎo)果蠅形態(tài)和生理變化與激素調(diào)控的關(guān)系，鐮倉(cāng)昌樹測(cè)定了喂蜂王漿的果蠅幼蟲的20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenile hormone，JH)生物合成量的變化，以及幼蟲成長(zhǎng)階段卵黃蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的變化。20E能縮短果蠅發(fā)育時(shí)間，JH和卵黃蛋白的基因表達(dá)產(chǎn)物能促進(jìn)果蠅產(chǎn)卵量。蜂王漿和MRJP1可提高排卵后3d果蠅的20E滴度、排卵后4d的JH和卵黃蛋白基因表達(dá)量。轉(zhuǎn)基因果蠅實(shí)驗(yàn)表明，20E、JH、卵黃蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物均與Egfr信號(hào)通路有關(guān)。20E的合成由Egfr的MAPK下游激活。且MRJP1激發(fā)的脂肪體Egfr信號(hào)通過(guò)了一條區(qū)別于調(diào)節(jié)個(gè)體大小和發(fā)育時(shí)間的路徑，即增加JH合成，最后增加卵黃蛋白的表達(dá)，在這些改變的基礎(chǔ)上來(lái)增強(qiáng)繁殖能力［3］。

為了確認(rèn)這個(gè)信號(hào)通路與級(jí)型分化有關(guān)，他們?cè)俜謩e喂養(yǎng)了用InR RNAi和Egfr RNAi的蜜蜂幼蟲。與對(duì)照組相比，Egfr RNAi組可縮小成蟲卵巢大小、延長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間，但I(xiàn)nR RNAi組不能。這種Egfr RNAi對(duì)蜂王級(jí)型分化的抑制在用MRJP1喂養(yǎng)的蜜蜂個(gè)體中也能發(fā)現(xiàn)。MRJP1像蜂王漿一樣通過(guò)幼蟲脂肪體中的Egfr激活MAPK和S6K。這些結(jié)果表明，MRJP1對(duì)Egfr的激活作用在蜜蜂的級(jí)型分化中是存在的。用RNAi干擾蜜蜂PI3K、PDK1、TOR和S6K能抑制用蜂王漿喂養(yǎng)蜜蜂引起的個(gè)體增大，但是不影響發(fā)育時(shí)間的變化和卵巢發(fā)育。蜂王漿或MRJP1能增加用40℃貯存30d的蜂王漿喂養(yǎng)的3日齡蜜蜂幼蟲的20E滴度、JH滴度和卵黃蛋白原(vitellogenin，vg)基因表達(dá)產(chǎn)物，以及卵黃蛋白前體，但apalbumin和酪蛋白不能。用蜂王漿飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲的20E表達(dá)量會(huì)受到Egfr RNAi、一種MAPK抑制體PD98059的抑制，但不會(huì)受S6K RNAi的抑制。用蜂王漿飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲的JH和卵黃蛋白表達(dá)量受到 Egfr RNAi抑制，而不會(huì)受 S6K RNAi和PD98059的抑制。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MRJP1通過(guò)激活Egfr下游的MAPK，促進(jìn)20E的生物合成，從而縮短蜜蜂幼蟲的發(fā)育時(shí)間。向工蜂幼蟲最大量地施用JH會(huì)導(dǎo)致類似蜂王的卵巢發(fā)育，但成蟲個(gè)體大小與工蜂一致，因此 MRJP1通過(guò)激活 Egfr，促進(jìn) JH pfu/μL增加，最終促進(jìn)了蜂王卵巢的發(fā)育。這種作用機(jī)制與MRJP1飼養(yǎng)的果蠅形態(tài)與生理變化機(jī)制是一致的［3］。

蜂王漿經(jīng)40℃貯存30d apalbumin-1蛋白僅降解10%，且向其加入apalbumin-1并不能誘導(dǎo)蜂王的產(chǎn)生，也不增加蜂王的出現(xiàn)率。但是MRJP1和用大腸桿菌表達(dá)重組的MRJP1均能誘導(dǎo)蜜蜂的級(jí)型分化，因此，只有單體MRJP1才是蜜蜂級(jí)型分化作用的影響因子。MRJP1通過(guò) Egfr延長(zhǎng)果蠅壽命，說(shuō)明MRJP1可能對(duì)延長(zhǎng)蜂王壽命發(fā)揮重要作用。這是第一次有證據(jù)證明Egfr與壽命調(diào)控有關(guān)［3］。

4 結(jié)論

雖然人類對(duì)蜂王漿與蜜蜂級(jí)型分化關(guān)系的認(rèn)識(shí)已有100多年歷史，但是對(duì)蜂王漿中發(fā)揮作用的成分及機(jī)理一直沒(méi)有定論。關(guān)于蜂王漿的作用機(jī)理，之前已有學(xué)者從營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)、分化關(guān)鍵時(shí)期、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、基因調(diào)控等多方面概述了蜜蜂級(jí)型分化的相關(guān)研究結(jié)果［1］。相關(guān)研究報(bào)道表明，蜜蜂級(jí)型分化是一個(gè)復(fù)雜的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)過(guò)程，許多重要生理因子參與其中，包括JH、蛻皮激素、胰島素/胰島素類似物信號(hào)通路等。JH決定級(jí)型發(fā)育軌跡，并能阻止卵巢發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的程序性死亡;蛻皮激素可協(xié)同JH的調(diào)節(jié)作用。蜂王與工蜂的個(gè)體大小及相關(guān)器官大小的級(jí)型特異性差異與胰島素/胰島素類似物信號(hào)通路密切相關(guān)［2］。Barchuk等根據(jù)已有研究提出了蜜蜂的級(jí)型分化模型:蜂王較高的JH滴度促進(jìn)了軀體生長(zhǎng)和卵巢發(fā)育而抑制了細(xì)胞凋亡及腦、后足特化構(gòu)造的發(fā)育;與之相反，較低的JH滴度使工蜂腦神經(jīng)發(fā)生增加及后足特化，從而抑制了軀體生長(zhǎng)、卵巢發(fā)育及細(xì)胞凋亡增加。經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生理生化過(guò)程，最終產(chǎn)生了級(jí)型分化現(xiàn)象［2］。關(guān)于蜂王漿中決定級(jí)型分化的關(guān)鍵成分，有報(bào)道認(rèn)為是其中的糖分，可能王漿中的糖分起到刺激取食的作用，加快了幼蟲取食及發(fā)育，但其作用機(jī)理如何，蜂王漿中其它成分對(duì)級(jí)型分化有何影響并不清楚［29-30］。鐮倉(cāng)昌樹的研究為人類認(rèn)識(shí)蜜蜂級(jí)型分化過(guò)程提供了重要的理論依據(jù)。

與此同時(shí)，鐮倉(cāng)昌樹的新發(fā)現(xiàn)也為人類認(rèn)識(shí)蜂王漿的營(yíng)養(yǎng)保健功能、功效成分、作用機(jī)理的提供了全新思路。蜂王漿是公認(rèn)的功能食品和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外蜂王漿貿(mào)易中將王漿酸含量高低作為衡量蜂王漿質(zhì)量及辨別真?zhèn)蔚淖钪饕闹笜?biāo)［31-32］。日本蜂王漿公正取引協(xié)會(huì)最早把王漿酸列為蜂王漿的質(zhì)量指標(biāo)，后來(lái)把進(jìn)口蜂王漿的王漿酸含量從最初的1.4%提高到2.0%～2.2%才算合格，導(dǎo)致我國(guó)一些生產(chǎn)企業(yè)從內(nèi)銷蜂王漿中提取王漿酸添加到出口產(chǎn)品［33］，使部分內(nèi)銷蜂王漿成為“空心漿”。我國(guó)現(xiàn)行蜂王漿標(biāo)準(zhǔn)把王漿酸、粗蛋白、總糖含量列為質(zhì)量指標(biāo)［34］。由于已發(fā)現(xiàn)MRJP1對(duì)人體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有促進(jìn)分裂、增殖、DNA合成等功能，預(yù)期今后MRJP1等蜂王漿主蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物和人類的功能和作用機(jī)理將成為研究熱點(diǎn)。我國(guó)是目前世界上蜂群數(shù)量最多的國(guó)家，每年產(chǎn)蜂王漿約2000t，產(chǎn)量和出口量占全球的60%～90%，主要出口國(guó)家和地區(qū)包括歐洲、美國(guó)和日本［7，32］，開展蜂王漿主蛋白的研究和功能食品的深度開發(fā)，將具有重要的經(jīng)濟(jì)和戰(zhàn)略意義。

［1］黃少康，陳盛祿.蜜蜂蜂王與工蜂級(jí)型分化研究進(jìn)展［J］.昆蟲知識(shí)，2002，39(3):176-181.

［2］李文峰，李志國(guó)，劉芳，等.蜜蜂級(jí)型分化相關(guān)生理因子研究進(jìn)展［J］.昆蟲知識(shí)，2010，47(5):856-861.

［3］Kamakura M.Royalactin induces queen differentiation in honeybees［J］.Nature，2011，473(3):478-483.

［4］劉光楠，張飛，顏偉玉，等.蜂王幼蟲與工蜂幼蟲發(fā)育期食物消耗量的研究［J］.應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，2011，48(1):113-115.

［5］Page R E，Peng C Y.Aging and development in social insects with emphasis on the honey bee，Apis mellifera L.［J］.Experimental Gerontology，2001，36(4-6):695-711.

［6］Wheeler D E.Developmental and physiological determinations of caste in social Hymenoptera:evolutionary implications［J］.American Naturalist，1986，128(1):13-34.

［7］沈立榮，張璨文，丁美會(huì)，等.蜂王漿的營(yíng)養(yǎng)保健功能及分子機(jī)理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2009，11(4):41-47.

［8］曹煒，尉亞軍.蜂產(chǎn)品保健原理與加工技術(shù)［M］.北京:化工出版社，2002:1-361.

［9］Howe S R，Dimick P S，Benton A W.Composition of freshly harvested and commercial royal jelly［J］.Journal of Agricultural Research，1985，24:52-61.

［10］Weinstock G M，Robinson G E，Gibbs R A，et al.Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera［J］.Nature，2006，443:931-949.

［11］Drapeau M D，Albert S，Kucharski R，et al.Evolution of the Yellow/Major Royal Jelly Protein family and the emergence of social behavior in honey bees［J］.Genome Research，2006，16:1385-1394.

［12］Albert S，Bhattacharya D，Klaudiny J，et al.The family of major royal jelly proteins and its evolution［J］.Journal of Molecular Evolution，1999，49(2):290-297.

［13］Salazar-Olivo L A，Paz-Gonzales V.Screening of biological activities present in honeybee(Apis mellifera)royal jelly［J］.Toxicology in Vitro，2005，19(5):645-651.

［14］Bilikova K，Hanes J，Nordhoff E，et al.Apisimin，a new serine-valine-rich peptide from honeybee(Apis mellifera L.)royal jelly:purification and molecular characterization［J］.FEBS Lett，2002，528(1-3):125-129.

［15］Tamura S，Amano S，Kono T，et al.Molecular characteristicsand physiological functions of major royal jelly protein 1 oligomer［J］.Proteomics，2009，24(9):5534-5543

［16］Kimura Y，Washino N，Yonekura M.N-linked sugar chains of 350-kDa royal jelly glycoprotein［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1995，59:507-509.

［17］Kimura M，Kimura Y，Tsumura K，et al.350-kDa royal jelly glycoprotein(apisin)，which stimulates proliferation of human monocytes，bears the beta1-3galactosylated N-glycan:analysis of the N-glycosylation site［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2003，67(9):2055-2058.

［18］Simuth J.Some properties of the main protein of honeybee(Apis mellifera)royal jelly［J］.Apidologie，2001，32:69-80.

［19］Simuth J，Bilikova K，Kovacova E，et al.Immunochemical approach to detection of adulteration in honey:physiologically active royal jelly protein stimulating TNF-alpha release is a regular component of honey［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52:2154-2158.

［20］Kamakura M，F(xiàn)ukuda T，F(xiàn)ukushima M，et al.Storagedependent degradation of 57-kDa protein in royal jelly:a possible markerfor freshness［J］ .Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2001，65(2):277-284.

［21］Kamakura M，Mitani N，F(xiàn)ukuda T，et al.Antifatigue effect of fresh royal jelly in mice［J］.Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2001，47(6):394-401.

［22］ Kamakura M，F(xiàn)ukushima M.Inhibition ofspecific degradation of 57 kDa protein in royal Jelly during storage by ethylenediaminetetraacetic acid［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2002，16:1385-1394.

［23］Kamakura M，Suenobu N，F(xiàn)ukushima M.Fifty-seven-kDa protein in royal jelly enhances proliferation of primary cultured rat hepatocytes and increases albumin production in the absence of serum ［J］ .Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，282:865-874.

［24］Kamakura M.Signal transduction mechanism leading to enhanced proliferation of primary cultured adult rat hepatocytes treated with royal jelly 57-kDa protein［J］.Journal of Biochemistry，2002，132:911-919.

［25］ Majtan J，Kovacova E，Blikova K，et al.The immunostimulatory effect of the recombinant apalbumin 1-major honeybee royal jelly protein-on TNFa release［J］.International Immunopharmacology，2006，6(2):269-278.

［26］Yamaguchi K，Kono T，Moriyama T.A new marker for evaluation of royal jelly［C］.Apicultural Science Association of China Abstracts，The 9th Asian Apicultural Association(AAA)Conference，Hangzhou:2008.

［27］Bilicova K，Simuth J.New criterion for evaluation of honey:quantification of royal jelly protein apalbumin 1 in Honey by ELISA［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58:8776-8781.

［28］Beetsma J.The process of queen-worker differentiation in the honeybee［J］.Bee World，1979，60:24-39.

［29］Asencot M，Lensky Y.The effect of soluble sugars in stored royal jelly on the differentiation of female honeybee(Apis mellifera L.)larvae to queens［J］.Insect Biochemistry，1988:127-133.

［30］Barchuk A，Cristino A，Kucharski R，et al.Molecular，determinants ofcaste differentiation in the highly eusocial honeybee Apis mellifera［J］.BMC Developmental Biology，2007(7):1-19.

［31］Sabatini A G，Gian Luigi，Marcazzan G L，et al.Quality and standardisation of royal jelly［J］.Journal of ApiProduct and ApiMedical Science，2009，1(1):1-6.

［32］洪梅，史伯倫.蜂王漿與10-羥基-2-癸烯酸［J］.蜜蜂雜志，2001(6):22-23.

［33］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB9697-2008蜂王漿［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

The key factor induces differentiation of queen and worker in honeybees-main royal jelly protein 1

LIU Dan-dan1，XIAO Fa1，YANG Xiao-li1，LI Mei-lu1，ZENG Yan-jun1，YU Zhang-ying1，SHEN Li-rong1，*，QIU Wei2，YIN Zhi-hong2
(1.College of Bio-systems and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China;2.Hangzhou Biyutian Health-care Production Co.，Ltd.，Hangzhou 311500，China)

TS201.1

A

1002-0306(2012)12-0371-05

2011-09-13 *通訊聯(lián)系人

柳丹丹(1988-)，女，碩士研究生，研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)。

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z324);浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011C22029);杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20110232B52)。