許大平 張在軍 李銘源

（中藥質量研究國家重點實驗室（澳門大學），澳門大學中華醫(yī)藥研究院，澳門 999078）

神經(jīng)退行性疾病是指一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元進行性喪失所導致的疾病狀態(tài)，主要包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病及肌萎縮性脊髓側索硬化癥等。隨著人口老齡化的加劇，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率在逐年增高，也越來越受到社會的關注。而目前的神經(jīng)退行性疾病治療方法無論從數(shù)量還是療效上都十分有限，為神經(jīng)退行性疾病尋找合適的治療方法也變得更加迫切。目前的神經(jīng)退行性疾病動物模型在預測治療有效性上仍有局限［1］，發(fā)展新的神經(jīng)退行性疾病動物模型并利用之進行有效藥物篩選成為一項很有意義的工作。

1 斑馬魚簡介

斑馬魚是一種市面常見的觀賞魚類，其體型纖細，對食物和水質要求不高。更重要的是斑馬魚繁殖能力強，雌魚每周可產(chǎn)卵一次，每次幾百枚。其卵子體外受精，體外發(fā)育，胚胎發(fā)育速度快，胚胎和幼魚身體透明，便于形態(tài)學觀察。作為一種脊椎動物，斑馬魚與人類基因組同源性高（約87%），基因組信號調控也與人類有很高的相似性［2］，所以在發(fā)育科學中，斑馬魚作為主要模式生物已經(jīng)有幾十年的應用歷史。

在人類疾病及治療方法的研究中，斑馬魚模型的起步較晚，但是發(fā)展很快。因為斑馬魚幼魚體積小（出生后7天約4 mm），能被放進96孔板進行實驗，使斑馬魚對化合物量的需求很小，并且能夠適應10%Dimethyl sulfoxide（DMSO）濃度的生存環(huán)境。這些特性使得斑馬魚在高通量先導化合物篩選上具有很大優(yōu)勢［3］，能夠縮短藥物的體內(nèi)研究時間。在神經(jīng)方面，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了斑馬魚在學習，睡眠，藥物成癮及其他神經(jīng)行為表型與人類相似，并且可以定量研究［4－7］。斑馬魚的整個神經(jīng)遞質系統(tǒng)，包括膽堿能，多巴胺能和去甲腎上腺素能通路已經(jīng)被闡明［8－9］。相比于其他無脊柱模式生物，斑馬魚出生后三天就開始發(fā)育功能完好的血腦屏障［10］。這些都說明了斑馬魚模型在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究上的優(yōu)勢。另外，斑馬魚的諸多特性使其在分子生物學操作上具有很大的靈活性，利用反義嗎啉代寡核苷酸法（Morpholino oligonucleotides）在胚胎發(fā)育早期對斑馬魚進行特定基因的暫時性沉默已經(jīng)成為應用廣泛的研究方法。在構建穩(wěn)定的轉基因品系方面，利用化學誘變，鋅指核酸酶或定向誘導基因組局部突變（Targeting induced local lesions in genomes，TILLING），能夠穩(wěn)定的敲除特定基因。mRNA注射或插入順式調控元件等可以在斑馬魚基因組中插入致病突變。本文主要圍繞斑馬魚構建的神經(jīng)退行性疾病模型，介紹其在神經(jīng)退行性疾病相關領域近幾年的發(fā)展。

2 斑馬魚神經(jīng)退行性研究及疾病模型

2.1 阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s Disease，AD）是發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性疾病，其在65－69歲人群中發(fā)病率為1.53%，而在80－85歲人群中的發(fā)病率高達30%［11］。病人腦部病理學特征為細胞外淀粉多肽沉積形成腦部斑塊，細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結伴有進行性神經(jīng)元減少［12］。病人表現(xiàn)為認知功能與記憶逐漸減退和行為錯亂，從而嚴重影響生活質量。阿爾茨海默病是癡呆發(fā)生的最主要原因，50%以上的癡呆都與阿爾茨海默病有關。隨著人口老齡化的增加，阿爾茨海默病是一個必須面對的嚴峻問題。阿爾茨海默病的病因和發(fā)病機制復雜，至今尚無完全明確。關于其發(fā)病機制的主要假說有β－淀粉樣蛋白毒性學說，微管相關蛋白tau異常學假說。

已知的一些與AD發(fā)病相關的基因，在斑馬魚上都有發(fā)現(xiàn)。在家族性早發(fā)型常染色體顯性遺傳阿爾茨海默病例中，其發(fā)病被認為與編碼β淀粉樣前體蛋白（β－amyloid procursor protein，APP）和早老素（Presenilin，PSEN1and 2）的基因突變有關［13］。而載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）和Sorting protein－related receptor containing LDLR class A repeats（SORL1）的基因變異也會導致個體患遲發(fā)型阿爾茨海默病風險增加。研究人員已在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了兩個編碼APP的同源基因（appa，appb），與人類的同源性約70%［14］。編碼早老素的同源基因psen1和psen2也在斑馬魚上有發(fā)現(xiàn)［15－17］。而與AD發(fā)病風險相關的ApoE和SORL1在斑馬魚生同樣發(fā)現(xiàn)了同源基因。這些研究證明了斑馬魚作為AD研究模型的可能性。

β－淀粉樣蛋白（β－amyloid，Aβ）的形成是由于β－淀粉蛋白前體（APP）的非正常剪切和錯誤折疊導致的。Aβ在腦中堆積產(chǎn)生細胞毒性作用，被認為是AD發(fā)病的病因之一。在斑馬魚中，發(fā)現(xiàn)了人APP的同源基因appa和appb［14］，以及與APP非正常剪切相關的β－內(nèi)分泌酶和γ－內(nèi)分泌酶同源基因［15，17］。但是斑馬魚體內(nèi)內(nèi)源性Aβ尚未被發(fā)現(xiàn)，從而也無從知道斑馬魚體內(nèi)APP的處理過程與人類的相似性。研究者們對在斑馬魚中建立Aβ毒性模型進行了諸多嘗試。在2009年第六屆歐洲斑馬魚發(fā)育與遺傳學會議上，有研究者報導嘗試通過插入人突變基因APPswe建立斑馬魚Aβ模型，但是并未顯示出明顯病理特征。Newman［18］等最近也嘗試構建一種新的表達Aβ淀粉樣蛋白同時又更易于觀察的斑馬魚AD模型用于高通量篩選。他們嘗試讓Aβ42淀粉樣蛋白特異性表達在斑馬魚黑色素細胞中。但是這種轉基因品系斑馬魚直到長成16個月的成魚才表現(xiàn)出明顯的色素異常，失去了早期高通量篩選的價值。

tau蛋白是一種磷酸蛋白，具有促進神經(jīng)元合成和穩(wěn)定神經(jīng)元的作用。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦中的tau蛋白發(fā)生了過度磷酸化，引起微管蛋白組裝紊亂，從而導致神經(jīng)元骨架變質和神經(jīng)元細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結（Neurofibrillarytangles，NTFs）。Tau在AD發(fā)病中的重要意義，吸引了研究者們構建斑馬魚tau模型的興趣。Chen［19］等發(fā)現(xiàn)了編碼微管相關蛋白tau在斑馬魚體內(nèi)的同源基因mapta和maptb。Tomasiewicz等［20］將綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標記的人類tau蛋白用顯微注射的方法打入1－2細胞期的斑馬魚胚胎中，注射后48 h即可觀察到蛋白的纏結，并最終在斑馬魚體內(nèi)形成于AD病人相似的神經(jīng)纖維纏結，從而構建出一種斑馬魚的AD模型。Bai等［21］構建了利用斑馬魚enolase－2啟動子表達GFP或人突變4－repeat tau，構建了穩(wěn)定遺傳的Tg（eno2：GFP）和Tg（eno2：Tau）品系。在Tg（eno2：Tau）品系中，tau在斑馬魚整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有表達并在視網(wǎng)膜，脊髓，軸突和神經(jīng)元胞體沉積并形成神經(jīng)纖維纏結。eno2啟動子在斑馬魚24－72days postfertilization（dpf）期間表達逐步增加，并可穩(wěn)定表達至其成年。因此，此研究同時提供了一個理想的調控元件來構建更多神經(jīng)退行性疾病模型。Paquet［22］也構建了一種穩(wěn)定遺傳的tau蛋白病變的斑馬魚轉基因模型：其利用Gal4／UAS表達系統(tǒng)為構建出了熒光蛋白標記的人tau蛋白，并在斑馬魚中迅速重現(xiàn)了與人類似的過磷酸化，神經(jīng)纖維纏結等病理特征和神經(jīng)功能與行為學異常等表征。值得一提的是，利用此模型Paraquat等篩選出了一種tau激酶GSK3β抑制劑，提示此模型在藥物初期篩選中具有很大潛力。Van Bebber［23］等利用這種tau蛋白病變的斑馬魚模型檢測了已進入臨床二期實驗的能延緩AD病人認知功能減退藥物亞甲基藍對tau蛋白毒性的保護作用，但是亞甲基藍沒有緩解此模型中的任何病理特征。

2.2 帕金森綜合癥

帕金森綜合癥（Parkinson’s disease，PD）是繼阿爾茨海默病之后第二大神經(jīng)退行性疾病，它一種影響運動功能的進行性發(fā)展的疾病。一般認為與黑質－紋狀體的多巴胺能神經(jīng)通路被破壞有關，其主要病理學特點就是中腦黑質中的多巴胺能神經(jīng)元大量死亡和Lewy小體的形成。病人一般出現(xiàn)運動緩慢，肌肉強直和震顫。與阿爾茨海默病相似，PD也是多因素誘發(fā)疾病，其發(fā)病機制復雜，至今尚未明確。研究表明，PD的發(fā)病與 α－synuclein［24］，parkin［25］，UCH－L1［26］，DJ－1，PINK－1 和LRRK2等基因突變有關。

由異常的α－synuclein蛋白聚集形成的Lewy小體是帕金森病的主要病理特征之一。但在斑馬魚中并未發(fā)現(xiàn)α－synuclein同源基因。但Prabhudesai等［27］構建了過表達人α－synuclein基因的斑馬魚模型，并觀察到神經(jīng)元凋亡。他們利用這個模型驗證了新型分子鑷CLR01在斑馬魚體內(nèi)能夠成功阻斷α－synuclein的聚集，顯著改善斑馬魚生存率。這個研究給斑馬魚模型用于抗PD藥物篩選提供了良好的例子。

DJ－1，parkin，PINK－1，LRRK2，uch－L1等在斑馬魚中都可以找到相應的同源基因，其中，DJ－1同源性為89%［28］，parkin同源性為75%［29］，PINK－1為62%［30］，LRRK－2同源性為71%［31］，UCH－L1為79%［32］。

在人早發(fā)型帕金森病中，編碼Parkin蛋白的PARK2基因是被發(fā)現(xiàn)突變概率最高的基因。斑馬魚同源基因park2所轉錄出的蛋白氨基酸序列與人類的有62%的同源性，在關鍵活性部位90%相同。Flinn等［29］利用morpholino對斑馬魚Parkin進行敲減后，3dpf斑馬魚出現(xiàn)了間腦多巴胺能神經(jīng)元減少的現(xiàn)象，并且對神經(jīng)毒素MPTP的敏感性增加。這也是目前為止唯一一個發(fā)現(xiàn)與人類PARK2相關帕金森病有相同表型動物模型，盡管現(xiàn)在還不知道斑馬魚中的多巴胺能神經(jīng)元減少時因為發(fā)育的推遲還是真正的神經(jīng)退行性變，但是這個模型仍然具有很重要的意義。人PARK2基因變異會造成線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活性下降，而park2敲減的斑馬魚表現(xiàn)出了同樣表征。

在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)中，park7表達的DJ－1遍布腦和脊髓［28］，Bretaud發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中和哺乳動物中，park7基因的功能具有非常強的保守性。Bretaud等用morpholino對park7進行敲減之后，并沒有影響斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，但是增加了多巴胺能神經(jīng)元對氧化損傷的敏感性［33］。而park7敲減的斑馬魚經(jīng)蛋白酶體抑制劑MG132處理后，表現(xiàn)出經(jīng)Bax和P53介導的多巴胺能神經(jīng)元凋亡。阻斷P53能夠有效抑制這種凋亡。此研究提示park7敲減的斑馬魚可能具有篩選神經(jīng)保護藥物的潛力。

Anichtchik等［30］對斑馬魚PINK1基因進行了敲除，敲除后的魚出現(xiàn)間腦多巴胺能神經(jīng)元減少，同時也出現(xiàn)脊柱彎曲，尾部發(fā)育不正常等現(xiàn)象。同時，與人類的帕金森病理特點一樣，PINK1敲除的斑馬魚也產(chǎn)生了更多自由基。LRRK2是常染色體顯性遺傳PD中常見的變異基因。Sheng［34］等在對斑馬魚與人類LRRK2的同源基因zLRRK2進行敲除的過程中發(fā)現(xiàn)，敲除整個zLRRK2基因會導致斑馬魚死亡，但是敲除zLRRK2的WD40區(qū)域卻可以造成斑馬魚的類帕金森病病理改變，如間腦多巴胺能神經(jīng)元減少和行為學異常。但是Ren等［35］最近的研究對此結果提出質疑，認為 WD40區(qū)域的敲除雖然消除了zLRRK2的表達，但是并沒有導致多巴胺能神經(jīng)元減少。由此可見，LRRK2基因在斑馬魚帕金森模型上的應用還需要更多研究。

神經(jīng)毒素是現(xiàn)今最常用的復制帕金森病動物模型的經(jīng)典工具。常用的神經(jīng)毒素有1－甲基－1，4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine，MPTP）以及6－羥基多巴胺。MPTP是一種能夠引起動物類帕金森病癥狀和病理的神經(jīng)毒素。MPTP于20世紀80年代在美國偶然被發(fā)現(xiàn)在人身上有引起帕金森癥狀作用［36］，后來引入動物實驗，用于帕金森病的造模［37］。帕金森現(xiàn)行的治療藥物左旋多巴和司來吉蘭都可以改善MPTP誘導的帕金森癥狀。Lam［38］首先將MPTP應用于斑馬魚幼魚并觀察到其多巴胺神經(jīng)元的顯著性減少，而其他神經(jīng)元不受影響。McKinley［39］等參照在哺乳動物中的造模，將 MPTP應用于斑馬魚幼魚中，他又用morphlino和特異性阻斷劑分別阻斷了神經(jīng)元細胞膜上的多巴胺轉運體（Dopamine transporter，DAT）和星型膠質細胞中的單胺氧化酶－B，均起到了對MPTP毒性的保護作用，由此說明在斑馬魚體內(nèi)MPTP作用機制與在人類和其他哺乳動物體內(nèi)大體相同，而不同于線蟲等無脊椎動物。這項研究建立了斑馬魚帕金森病的高通量篩選模型。在McKinley之前，Bretaud等［40］在成年斑馬魚上測試MPTP毒性也取得了不錯的結果，但是其研究側重點在于利用斑馬魚研究帕金森病的發(fā)病機理。6－OHDA也是一種與MPTP相似的能夠造成多巴胺神經(jīng)元損傷的神經(jīng)毒素［41］，但是其不能通過血腦屏障，所以一般采取微注射的方式進行給藥。

在斑馬魚帕金森模型中觀察藥物的保護作用，除了觀察其行為學改變［42］外，更重要的是觀察間腦多巴胺神經(jīng)元是否減少。而現(xiàn)行的方法無論是原位雜交還是免疫染色操作都比較復雜。研究者一直致力于建立能夠直觀觀察多巴胺能神經(jīng)元的穩(wěn)定遺傳轉基因斑馬魚品系。已報道的幾個研究都嘗試利用多巴胺生物合成途徑中的基因來建立在多巴胺能神經(jīng)元中特異性表達熒光蛋白的模型［43－46］，但是都不能達成理想的效果。

2.3 亨廷頓舞蹈癥

亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）是一種單基因遺傳性神經(jīng)退行性疾病，主要病因是患者第四號染色體上的huntingtin（Htt）基因發(fā)生變異，產(chǎn)生了變異的蛋白質（聚谷氨酰胺），該蛋白質在細胞內(nèi)逐漸聚集，形成大的分子團。一般患者在中年發(fā)病，逐漸喪失說話、行動、思考和吞咽的能力，病情大約會持續(xù)發(fā)展15年到20年直到最后死亡。目前HD并無特異有效治療方法，一些藥物可以延緩癥狀但是不能阻止疾病發(fā)展。

在斑馬魚中，Htt基因已經(jīng)被克隆，其表達的蛋白含有3121個氨基酸，與人類的同源蛋白有70%同源性［47］。用morpholino對斑馬魚Htt基因進行敲除后可引發(fā)一系列發(fā)育變化包括頭眼變小，色素變淺等［48］。Schiffer等［49］將綠色熒光標記的N端帶有不同長度的聚谷氨酰胺（PolyQ）的Htt mRNA注射入斑馬魚胚胎內(nèi)，隨著PolyQ的增長，胚胎發(fā)育中的異常和凋亡就更加明顯。這個研究也再次證明了Miller等［50］之前發(fā)現(xiàn)的polyQ 56或以上都可以在斑馬魚胚胎中產(chǎn)生包涵體并引起毒性作用。Schiffer等在斑馬魚身上應用了Hsp40和Hsp70兩種在無脊椎HD模型中可以polyQ聚集的物質，在斑馬魚上也取得了很好的效果。但是這兩種物質卻不能阻止polyQ的毒性作用。最近，Williams等［51］建立了一種表達 GFP－Huntington［71Q］的轉基因斑馬魚品系，一些在哺乳動物體內(nèi)阻止polyQ聚集的物質在這個斑馬魚模型中也有同樣效果。因此，這個轉基因斑馬魚品系以后可以被用來進行治療HD藥物的先導化合物體內(nèi)篩選。

2.4 肌萎縮性脊髓側索硬化癥（ALS）

Amyotrophic lateral sclerosis（ALS）是一種在脊髓，腦干和運動皮層中運動神經(jīng)元選擇性丟失的神經(jīng)退行性疾病。主要表現(xiàn)為肌無力肌萎縮。家族遺傳性ALS的發(fā)病與superoxidase dismutase 1（SOD1）基因的突變有關［52］。Lemmens等用注射mRNA的方法造成SOD在斑馬魚體內(nèi)的過表達突變。其結果是斑馬魚感覺神經(jīng)元無形體變化，但運動神經(jīng)元出現(xiàn)變短和異常分枝等，與人類的ALS病理特點類似。這個模型可能對研究運動神經(jīng)元對于SOD過表達的易感性有很大幫助。同時，Lemmens也發(fā)現(xiàn)，激發(fā)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在斑馬魚體內(nèi)的過表達，會減少SOD過表達對運動神經(jīng)元的損害，反之則會加劇。這與哺乳動物模型中的效果一樣。說明斑馬魚ALS模型至少在一些生理過程方面與哺乳動物模型是相同的。

3 總結與展望

斑馬魚因為其體積小，成本低，繁殖速度快，易于觀察以及與人類相對高的同源性和眾多的轉基因品系，成為了藥物初步體內(nèi)篩選的上佳選擇。近年來在神經(jīng)退行性病變研究領域，斑馬魚的關注度越來越高。盡管與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較大的區(qū)別，斑馬魚在基本的神經(jīng)傳導系統(tǒng)、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞類型以及與疾病相關基因同源性上與人類都很相似?，F(xiàn)在，用化學物質造模的神經(jīng)退行性變模型已經(jīng)得到了廣泛的應用。對斑馬魚與人類疾病相關的基因同源性的研究也有助于對人類神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的深入了解。越來越多的斑馬魚神經(jīng)退行性變轉基因品系正在問世，為以后新的藥物和治療方法的研究提供了廣闊的空間。

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