宋光桃

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院園林學院，湖南衡陽 421005)

分子系統(tǒng)學在菌物分類研究中的應用

宋光桃

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院園林學院，湖南衡陽 421005)

菌物的傳統(tǒng)分類主要依賴其形態(tài)和生理特征，常引起分類系統(tǒng)意見分歧.分子系統(tǒng)學技術是從遺傳的角度反映菌物種群的關系，能更客觀地反映菌物的系統(tǒng)進化.通過概述分子系統(tǒng)學的主要技術方法描述了其在菌物系統(tǒng)分類研究中的應用.參28.

分子系統(tǒng)學;菌物;分類

人類認識和利用菌物已有兩千多年的歷史，在公元前一世紀左右我國所著的《神農(nóng)本草經(jīng)》里就有如靈芝、伏苓等菌物的記載了，但“菌物”概念的提出只有幾十年的時間，它最早是由我國裘維蕃教授在1991年提出的［1］.廣義的菌物包括有真菌、卵菌和黏菌，它們在森林、土壤、湖泊、海洋等處廣泛分布，其中有美味可口的著名食用菌，有療效獨特的珍貴藥用菌，也有許多植物和動物的病原菌等.它們在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、環(huán)境保護等多方面與人類的生存息息相關.菌物種類多，2008年出版的《菌物字典(Ainsworth ＆ Bisby’s Dictionary of the Fungi，10th Edition)》第10版中就記載了97 861種菌物［2］，故目前世界上已知菌物約10萬種左右，我國已知的菌物約為14 700種左右［3］.有專家預計，全世界菌物種類約為150萬種，我國也不低于20萬種.因此在自然界里還有大量的菌物等待人類去發(fā)現(xiàn)和認識，并進而加以開發(fā)和利用.傳統(tǒng)的菌物分類鑒定是以其形態(tài)學特征、生長特性以及生理生化指標為基礎的，然而菌物的外觀形態(tài)特征復雜，它是菌物細胞內部基因與外界環(huán)境因素之間綜合作用的結果，而且一些菌物的形態(tài)特征、生長特性和生理生化指標隨著環(huán)境的變化也不穩(wěn)定;另外，還有部分菌物人工培養(yǎng)比較困難或目前根本不能人工培養(yǎng)，難以用形態(tài)學的方法進行描述，同時，形態(tài)學方法也很難區(qū)分形態(tài)相似的種、變種及生理小種.因此，用傳統(tǒng)方法對菌物進行系統(tǒng)分類鑒定常常會出現(xiàn)誤差和引起意見分歧.分子系統(tǒng)學是在分子水平上對生物進行遺傳多樣性、分類、系統(tǒng)發(fā)育和進化等方面的研究，能揭示生物進化的歷程和機理.因此在菌物的現(xiàn)代分類系統(tǒng)中引入了分子系統(tǒng)學技術.本文主要簡述分子系統(tǒng)學的主要技術方法及其在菌物分類研究中的應用.

1 核酸摩爾百分含量分類技術

在菌物的不同綱、目、科、屬、種之間，其 DNA(G+C)mol% 含量是不同的，并且它們都有特定的DNA(G+C)mol%含量.若兩菌物間的遺傳關系較近，則其個體間的DNA(G+C)mol% 含量就較相似，反之，若兩菌物間的遺傳關系較遠，則其個體間的DNA(G+C)mol% 含量差異就較大.通常若兩菌物為同一個種，則其DNA(G+C)mol%含量差異在4% ～5% 的范圍內;若兩菌物不是同一個種，則其DNA(G+C)mol%含量差異在10% ～15% 的范圍內;若兩菌物不是同一個屬或同一個科，則其DNA(G+C)mol%含量差異達20%～30%［4］.用DNA(G+C)mol% 含量技術方法進行分類重在否定，即兩菌物間若其DNA(G+C)mol% 含量差異較大就可判定它們不是同一個種.但若其含量相同或相近則不能肯定它們是同一個種，因為其DNA堿基序列之間可能存在差異，故當兩菌物間的DNA(G+C)mol% 含量相同或相近時，還要借助其它方法綜合分析才能確定其分類地位.

2 聚合酶鏈式反應技術

PCR技術是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法.該技術是由Mullis等［5］在 20世紀80年代中期創(chuàng)立的.由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增.它具有靈敏度高、特異性強、快速經(jīng)濟、操作簡便等諸多優(yōu)點［6］.用PCR技術來鑒定菌物，其主要作用機理是使用不同的引物，PCR擴增出不同的產(chǎn)物，即選擇某一特定引物就可擴增到相應的DNA片段.目前PCR技術結合其它技術(如RFLP技術、RAPD技術等)已廣泛用于菌物的檢測和分類研究中.

3 限制性內切酶片斷長度多態(tài)性技術

RFLP技術是利用限制性核酸內切酶能特異地識別DNA分子雙鏈上的特定堿基序列，并在特定序列處切開DNA分子，產(chǎn)生限制性的片段.由于不同菌物個體間的DNA序列存在著差別，若這種差別正好位于內切酶的酶切位點上，并使內切酶能識別的序列變?yōu)椴荒茏R別的序列或使本來不是內切酶識別位點上的DNA序列變?yōu)槲挥趦惹忻傅淖R別位點之上，若這時用限制性核酸內切酶對該DNA序列進行酶切時，就會出現(xiàn)少一個或多一個酶切位點，其結果就會出現(xiàn)少一個或多一個酶切片段.這樣用同一種限制性核酸內切酶對不同菌物的DNA序列進行酶切時，就會產(chǎn)生長度大小不同、數(shù)量不等的限制性酶切片段，再將這些片段經(jīng)過電泳、轉膜、變性，然后用標記好的相應的DNA探針與這些片段雜交，顯示出的圖譜就可以反映出基因組DNA堿基序列組成是否存在差異.因此，RFLP技術的基礎是通過限制性核酸內切酶的酶切片段長度的多態(tài)性來揭示DNA堿基序列組成的異同.目前，RFLP技術已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究中［7］.RFLP技術在菌物分類上主要用于菌物DNA同源性的比較，如Anderson等［8］利用RFLP技術研究密環(huán)菌屬(Armillaria)的分類.Tan等［9］利用 RFLP技術研究小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis)相關變種rDNA的變異情況.隨著PCR技術的問世，在RFLP技術中引入了PCR技術后，人們就能根據(jù)自己的目的隨意地研究生物體內不同區(qū)段的DNA，而且其酶切圖譜也更易于分析，使生物體多態(tài)性分析更加快速簡捷.這一方法在菌物分類研究中也得到了應用［10］.

4 隨機擴增多態(tài)性DNA

RAPD技術是在1990年由Williams和Welsh等發(fā)明并發(fā)展起來的，是建立在PCR技術基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子技術.其原理是以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(Taq酶)的作用下，進行PCR擴增.其擴增出的每一種DNA片段代表一個遺傳位點.擴增出的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺進行電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，再在紫外透視儀上檢測擴增產(chǎn)物DNA片斷的多態(tài)性.擴增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性.RAPD技術現(xiàn)已廣泛應用于菌物的品種鑒定、系譜分析、進化關系分析、抗病基因定位和遺傳圖譜構建等的研究中［11，12］.Guthrie等［13］利用RAPD標記技術對采自美國約翰生草及美國、印度、非洲、玻多黎各島的高梁上15種炭疽病菌分離物(C.graminicola)進行了鑒定，認為這是快速鑒定分離物間的差異的方法.閻培生等［14］利用RAPD技術研究鑒定木耳屬的不同菌株，發(fā)現(xiàn)用引物S4和S6與供試菌株基因組DNA的結合點少而且保守，其擴增的DNA指紋在木耳屬的不同種間特異性明顯，故可用此技術快速準確鑒定木耳屬的不同種.陳作紅等［15］利用RAPD技術研究鵝膏菌屬真菌的親緣關系，認為RAPD技術適合分析種內遺傳多樣性和親緣關系，對于分析種間或近緣屬間的親緣關系存在一定局限性.陳永青等［16］利用RAPD技術研究擬莖點霉(Phomopsis)18種29個菌株，其研究結果與形態(tài)學分類結果基本一致，多數(shù)種內不同菌株間以較高相似性系數(shù)聚在一起，而不同種間則以較低水平相聚，說明用RAPD技術鑒定該屬種級水平是合理和可行的.

5 擴增片斷長度多態(tài)性技術

AFLP技術是于1992年由Zabeau和Vos發(fā)明并發(fā)展起來的基于PCR技術和RFLP技術的DNA指紋技術，是一種選擇性擴增限制性片段的技術.由于不同物種的基因組DNA大小不同，利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內切酶酶切研究對象的基因組DNA序列后，可產(chǎn)生分子量大小不同、長度不同的限制性酶切片段，然后使用特定的人工雙鏈接頭與酶切的DNA片段連接作為擴增反應的模板，用含有選擇性堿基的引物對模板DNA進行擴增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴增片段的特異性，只有那些限制性位點側翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴增.再將擴增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，最后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無及擴增片段的長度與數(shù)量來檢驗其多態(tài)性［17］.由于AFLP技術結合了RFLP技術和RAPD技術的特點，被認為是一種十分理想的分子標記.目前該技術已在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、基因定位以及分類學等領域得到廣泛應用［18］.并已用于菌物研究中［19］.何月秋等［20］利用AFLP 技術，用 94 對引物分析了稻瘟病菌3個起始菌株和9個致病變異株，發(fā)現(xiàn)其中有49對引物能辨別出起始菌株間的親緣關系以及起始菌株與變異菌株間的關系.9個變異菌株中有4個菌株的條帶數(shù)變化無明顯，5個菌株的條帶數(shù)減少了1～3條.

6 核糖體DNA基因核苷酸序列分析

核糖體DNA(rDNA)編碼的基因核苷酸序列存在著可變區(qū)和高變區(qū)，在其進化過程中又具有很強的保守性，所以在菌物分類研究中分析其rDNA基因核苷酸序列是研究熱點之一.目前常用于鑒定未知菌物核苷酸序列的目的基因片段有18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA等.位于18S rDNA的5'端與28S rDNA的3'端間的序列被稱為ITS序列(internal transcribed spacers，核糖體內轉錄間隔區(qū))，其中包括ITS1(內轉錄間隔區(qū)1)位于18S r DNA與5.8S rDNA間、ITS2(內轉錄間隔區(qū)2)位于5.8S rDNA與28S rDNA間和5.8S rDNA的基因序列.ITS序列中含有2個不同的非編碼區(qū)域(ITS1與ITS4).由于ITS序列具有在菌物種間高度變異性及種內穩(wěn)定性的特征，這就為菌物的分子檢測鑒定提供了理想的靶序列［21］，因而使得菌物種的分類鑒定更為快速、準確、穩(wěn)定、可靠.ITS序列分析已用于菌物種間、屬內、近緣屬間以至科內系統(tǒng)進化關系的研究中，其保守區(qū)DNA序列可作為科、屬的鑒別特性，可變區(qū)的DNA序列可鑒別種間物種.葉明［22］采用ITS區(qū)序列分析研究了粒毛盤菌屬(Lachnum)的系統(tǒng)發(fā)育關系.李河等［23］采用ITS區(qū)的序列分析與形態(tài)特征觀察相結合鑒定油茶葉枯病菌為小孢擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis microspora).楊紅等［24］采用 ITS區(qū)的序列分析尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum.f sp.vasinfectum)異核與同核菌株，表明ITS區(qū)分析對鐮刀菌屬內種間鑒別有參考價值.但對種內或種以下的鑒定不適合.唐建輝等［25］利用ITS的通用引物(ITS1/ITS4)擴增西瓜炭疽病菌的ITS區(qū)段，并登錄GeneBank數(shù)據(jù)庫，將其序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中炭疽菌屬的其它24種炭疽菌的ITS序列進行比較分析，研究了炭疽菌屬的系統(tǒng)發(fā)育情況.

7 DNA分子雜交技術

DNA分子雜交技術又稱DNA探針技術，是利用DNA分子的變性、復性以及堿基互補配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進行探查的新技術.其原理是具有互補堿基序列的DNA分子，可以通過堿基對之間形成氫鍵等方式形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū).在進行DNA分子雜交之前，先將兩菌物的DNA分子提取出來，再通過加熱或提高pH值等方法，將雙鏈DNA分子分離成為單鏈(即變性).再將兩菌物的DNA單鏈放在一起進行雜交，其中一種菌物的DNA單鏈事先用同位素等進行標記.如果兩菌物DNA分子之間存在互補的部分，就能形成雙鏈區(qū)(即復性).由于同位素等標記被檢出的靈敏度高，即使兩菌物DNA分子之間形成百萬分之一的雙鏈區(qū)也能夠被檢測出來.核酸分子雜交序列的同源性主要以雜交百分率和雜交復合體的熱穩(wěn)定性來衡量.若兩菌物之間的親緣關系越近，則其共有的多核苷酸相同序列就越多，即同源百分率就越高.在菌物分類研究中，除近似種外，其余序列的同源性都較低［26，27］.因此，菌物 DNA 分子雜交技術主要用于鑒定親緣關系較近的種或種內分離物［28］.

［1］裘維蕃.農(nóng)園植病談叢［M］.北京:中國科學技術出版社，1991.

［2］賀新生.《菌物字典》第10版菌物分類新系統(tǒng)簡介［J］.中國食用菌，2009，28(6):59-61.

［3］戴玉成，莊劍云.中國菌物已知種數(shù)［J］.菌物學報，2010，29(5):625-628.

［4］邢來君，李明春.普通真菌學［M］.北京:高等教育出版社，1999.271-274.

［5］魏蘭芳，姬廣海，張世光.云南馬鈴薯青枯病菌的PCR檢測［J］，西南農(nóng)業(yè)大學學報，2002，24(1):72-74.

［6］任毓忠，李 暉，李國英，等.哈密瓜細菌性果斑病種子帶菌的 PCR檢測.新疆農(nóng)業(yè)科學，2004，41(5):329-332.

［7］黨進軍，孫志賢.DNA限制性片段長度多態(tài)性［J］.生物化學與生物物理進展，1986，(4):12-16.

［8］ Anderson J B and Stasovski E.Molecular phylogeny of northern hemisphere species ofArmillaria［J］.Mycologia，1992，84:505-516.

［9］Tan M K et al.Characterization of nuclear ribosomal DNA(rDNA)inGaeumannomyces graminisand correlation of rDNA variation withG.graminisvarieties［J］.Mycol Res，1994，98(5):553-561.

［10］郭成亮.腥黑粉菌(Tilletia)部分種ITS rDNA限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的研究［D］:［博士學位論文］.哈爾濱:東北林業(yè)大學，1995.

［11］季 靜，王 罡，Belhassen E，Serieys H and Bervill A.運用Bulked DNA-RAPD方法尋找向日葵細胞質雄性不育核恢復基因Rf1探針研究［J］.中國科學，1996，26(4):377-384.

［12］李松濤，張忠廷，王 斌，等.用新的分子標記方法(RAPD)分析小麥抗白粉病基因Pm4a的近等基因系［J］.遺傳學報，1995，22(2):103-108.

［13］Guthrie P A I .Differentiation of Fusaruim solani f.sp.cucurbitae races 1 and 2 by random amplification of polymorphic DNA［J］ .Curr Genet，1991，20(5):391-396.

［14］閻培生，羅信昌，等.利用RAPD技術對木耳屬菌株進行分類鑒定的研究［J］.菌物系統(tǒng)，2000(1):29-33.

［15］陳作紅，等.應用RAPD技術對鵝膏菌屬真菌親緣關系的研究［J］.菌物系統(tǒng)，2000(3):51-55.

［16］陳永青，姜子德，戚佩坤.RAPD分析與ITS的序列分析在擬莖點霉分類鑒定上的應用［J］.菌物系統(tǒng)，2002，21(1):39-46.

［17］Vos P，Hogers R，Bleeler M，et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucl Acids Res，1995，23:4407-4414.

［18］Thomas C，Vos C，Zabeau M，et al.Identification of amplified restriction fragment length polymorphism(AFLP)markers lightly linked to the tomato C f-9 gene for resistence to Clado sporium fluvum ［J］.The Plant Jour，1995，8:785-794.

［19］Mueller D G，Lipari S E，Milgroom M G.Amplified fragment length polymorphish(AFLP)fingerprinting of symbiotic fungi cultured by the fungus-growing ant Cy-phomyrmex minutus［J］.Mol Ecol，1996，5:119-122.

［20］何月秋，Hei Leung，Robert S Zeigler，等.稻瘟病菌變異菌株的 AFLP分析［J］.菌物系統(tǒng)，2002，21(3):363-369.

［21］趙 杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子檢測中的應用［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學，2004，4:35-37.

［22］葉 明，莊文穎.粒毛盤菌屬種間關系的分子系統(tǒng)學初探［J］.菌物系統(tǒng)，2002，21(3):340-345.

［23］李 河，周國英，盧麗俐.油茶葉枯病原的形態(tài)及ITS序列分析鑒定［J］.福建林學院學報，2008，28(1):88-91.

［24］楊 紅，李 穎，吳國華，等.尖孢鐮刀菌異核體及其不同核型分離子rDNA ITS區(qū)序列分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2002，10(4):381-384.

［25］唐建輝，王 偉.西瓜炭疽菌核糖體基因ITS區(qū)段的克隆及序列分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35(9):2566-2568.

［26］ Vilgalys R and Johnson J.Extensive genetic divergence associated with speciation in filamentous fungi［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1987，84:2355-2358.

［27］Horgen P et al.The Nucleotide sequence homologies of unique DNAs of some cultivated and wild mushrooms［J］.Can J Microbiol，1984，30:587-593.

［28］Vilgalys R.Genetic relatedness among anastomosis groups in Rhizoctoniaas measured by DNA/DNA hybridization［J］.Phytopathology，1988，78:698-702.

The Application of Molecular Systematics in the Study of Fungal Classification

SONG Guang-tao
(College of gardening，Hunan Environment-Biologic Polytechnic，Hengyang 421005，China)

The traditional classification of fungi rely on mainly its morphological and physiological characteristics，and cause differences of opinion in the classification system.Molecular systems technologies described the relationship between the fungi populations from a genetic perspective，and can reflect more objectively the phylogenetic relationships of fungi.This article provides an overview of the main technical methods of the molecular systematics and the application in fungi classification.28refs.

Molecular systematics;Fungi;Classification

Q75

A

1671－6361(2012)02－0004－04

2012－05－28

宋光桃(1965－)，女，湖南衡南人，副教授，研究方向:森林保護及微生物學.