盧創(chuàng)新 崔瑤 李曉燕 周云

己糖激酶(Hexokinase，H K-Ⅱ)是腫瘤組織中糖酵解的限速酶，它在腫瘤組織中表達(dá)的量及活性的增加，使得腫瘤組織在乏氧的情況下為瘤細(xì)胞本身的生長和增生提供必需的能量［1］。槲皮素具有廣譜的抗腫瘤作用，但其促腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在對槲皮素促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的凋亡機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株由本實驗室保存。RPM I-1640培養(yǎng)液，美國Hyclone;胎牛血清購自Gibico公司，噻唑藍(lán)(MTT)、Annixin-v、PI購自 Sigma公司;槲皮素購于哈藥集團(tuán)制藥六廠;羊抗HK-Ⅱ多克隆抗體購自santa cluz，S-P試劑盒購于北京中杉金橋。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 采用人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系，于37℃、5%CO2飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每2～3 d傳代一次。槲皮素在培養(yǎng)中的終濃度分別為12.5 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L?？瞻讓φ战M不加藥，以等量培養(yǎng)液代替。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 將對數(shù)生長的人結(jié)腸癌細(xì)胞，2 ml/孔接種于6孔板，分別加入槲皮素組和對照組各處理組試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各處理組細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μL AnnexinV/FITC和P I 10 μL，旋渦混勻，室溫避光染色15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。

1.4 細(xì)胞免疫化學(xué) 常規(guī)制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定。按免疫組化SP法步驟進(jìn)行，用PBS代替一抗作為陰性對照。己糖激酶主要在胞漿表達(dá)，呈棕黃色，空白對照呈陰性。200倍鏡下隨機(jī)取5個視野，計算每個視野陽性細(xì)胞數(shù)，陽性反應(yīng)者用德國LeicaQ550 cw圖像分析系統(tǒng)在統(tǒng)一光強(qiáng)，統(tǒng)一放大倍數(shù)(200)下測量表達(dá)情況，以染色最淡的視野為起點，隨機(jī)選取視野測定其灰度值作為陽性表達(dá)的量化指標(biāo)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物組對SW480細(xì)胞凋亡的影響 選擇槲皮素的5個濃度組進(jìn)行實驗，各組藥物分別作用SW480細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)各濃度組槲皮素誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡能力均高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，并隨濃度升高而逐漸升高(P＜0.05)。

2.2 槲皮素作用前后SW480細(xì)胞中己糖激酶蛋白表達(dá)的比較 正常己糖激酶蛋白主要在胞漿表達(dá)，呈棕黃色均勻染色為陽性表達(dá)。對己糖激酶表達(dá)陽性的樣本行圖像分析，測其灰度值作為其表達(dá)強(qiáng)度的量化指標(biāo)?；叶戎蹬c實際表達(dá)強(qiáng)度成反比。己糖激酶在槲皮素作用48 h后，隨槲皮素濃度升高而表達(dá)強(qiáng)度逐漸下降，與空白對照相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞中糖酵解活躍，依靠糖酵解獲取能量是其主要的能量獲取方式［2］。高糖酵解與線粒體結(jié)合型HKI、HKII高表達(dá)相關(guān)。實驗證實在四種HK的同工酶中，HKⅡ與腫瘤相關(guān)性最大。腫瘤細(xì)胞中高水平線粒體結(jié)合型HKII能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而繼續(xù)生長增殖。腫瘤特征性的糖代謝酶類，就像腫瘤中其他的調(diào)節(jié)因子一樣，也引起了人們的關(guān)注。從一定程度地抑制或影響這類調(diào)節(jié)因子，可以影響腫瘤的能量代謝，而正常細(xì)胞不受影響。因此，針對HK-Ⅱ的治療可能為治療高葡萄糖代謝腫瘤提供一個新的策略。通過RNA干擾技術(shù)沉寂基因表達(dá)來抑制HK-Ⅱ的合成，其可行性及有效性已獲得實驗證實。

從既往實驗室研究來看，槲皮素都顯示出一定的抗癌效果，多通過提升自身免疫力來發(fā)揮治療作用［1，2］，對正常組織的損失很小。若能證實其具有直接的抗腫瘤作用，將有較大意義，可為結(jié)腸癌等實體瘤的治療提供有益的方法和實驗依據(jù)。在本實驗中研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的凋亡的能力，并隨濃度升高而增強(qiáng)，在此過程，己糖激酶的表達(dá)水平受到影響，并隨槲皮素的濃度升高而表達(dá)下降，可以推測，正是槲皮素抑制了己糖激酶的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞的糖酵解正常程序陷入紊亂，進(jìn)而誘發(fā)了凋亡信號通路，促進(jìn)其凋亡。但是，槲皮素抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中己糖激酶表達(dá)的機(jī)制，尚需進(jìn)一步的實驗研究。

［1］吳平安，李國華.HK-Ⅱ與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展.實用臨床醫(yī)學(xué)，2009，10:133-134.

［2］Wilson J E.Hexokiunses.Bey Physiol Biochem Pharmacol，1995，126:65-198.

［3］張軍暉，邢念增，康寧，等.槲皮素對TRAMP-C2前列腺癌細(xì)胞的抑制作用.中華實驗外科雜志，2006，23(10):1240-1241.