范曉寧

深圳南山區(qū)人民醫(yī)藥感染科，廣東深圳 518052

目前在我國，慢性乙型肝炎已經(jīng)成為了一種臨床常見傳染性病癥。慢性乙型肝炎會引起肝衰竭、肝硬化以及原發(fā)性肝細胞癌等并發(fā)癥，給患者及其家屬帶來了嚴重的經(jīng)濟損失和心理負擔，同時也給社會帶來一定的影響[1]。在現(xiàn)階段對慢性乙型肝炎進行治療的方法主要有抗病毒、抗纖維化、抗炎保肝、免疫調(diào)節(jié)以及對癥治療等幾種方式，在這眾多方法中抗病毒是對慢性乙型肝炎進行治療的重中之重。目前國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的可以用來對慢性乙型肝炎患者進行抗病毒治療的藥物主要有干擾素和核苷酸類似物這兩大類，干擾素類主要包括有普通IFNα-2b與聚乙二醇化IFNα-2a/2b;核苷(酸)類似物主要包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋以及替比夫定等。HBV是DNA病毒的一種，其自然史需要歷經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的一個階段，然而逆轉(zhuǎn)錄酶對3,-5，外切酶相對比較缺乏，因此會使HBV很容易發(fā)生突變，所以在患者的體內(nèi)其實病毒是以準種的形式存在[2]。在本次研究中，處于對HBV核苷類似物耐多藥的檢測進行分析的目的，我們抽取在過去一段時間在我院就診的患有慢性乙型肝炎發(fā)生多藥耐藥的患者病例的臨床治療資料進行分析。以下為本次研究的結(jié)果報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機抽取在2005～2011年這對時間內(nèi)在我院就診慢性乙型肝炎患者發(fā)生多藥耐藥的病例18例，在所抽取的患者中有男性患者11例以及有女性患者7例，所有患者的年齡均在26～67歲之間，患者的平均年齡在44歲左右，以上所統(tǒng)計的患者的所有自然資料均不具有明顯的統(tǒng)計學差異，可以在分析中予以應(yīng)用。

1.2 診斷標準

患者接受拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋以及替比夫定等單獨用藥或者是聯(lián)合用藥進行治療，并且存在治療失敗的情況，主要有發(fā)生了病毒學的突破或者是在進行治療的48周后HBV DNA依舊比檢測下限的患者要高，對依從性差等原因予以排除，自愿對詳細病史資料予以提供并且通過病毒耐藥檢測被診斷為是多藥耐藥[3]。

1.3 方法

對所抽取的18例患者中采用克隆測序法在每位患者體內(nèi)隨機篩選60個克隆，對菌液聚合酶鏈反應(yīng)以及經(jīng)酶切進行鑒定結(jié)果為陽性的單克隆予以測序，并對患者出院3個月后進行隨訪，對患者的基因型以及耐藥基因變異的模式進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在本次研究過程中所得到的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，均采用SPSS 14.0統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理軟件進行處理分析，當P＜0.05時，我們認為數(shù)據(jù)之間有明顯的統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

對這18例患者出院后3個月進行隨訪，11例男性患者中HBeAg均呈現(xiàn)為陽性結(jié)果，7例女性患者的HBeAg均呈現(xiàn)陰性。在這其中被診斷為乙肝后肝硬化和肝細胞癌的患者有5例，被診斷為乙肝后肝硬化的患者有5例，其他的8例患者均被診斷為慢性乙型肝炎。在這18例患者中的所有標本的巢式PCR擴增均呈現(xiàn)陽性結(jié)果，陰性對照沒有發(fā)生擴增。

3 討論

作為強且有效的抗HBV藥物,核昔(酸)類似物目前正面臨著HBV耐藥性所產(chǎn)生的嚴重挑戰(zhàn)。正如過去的研究結(jié)果所說的那樣,現(xiàn)階段的核昔(酸)類似物不會對細胞核內(nèi)的cccDNA產(chǎn)生較好的效果,所以在停藥之后病毒的載量會出現(xiàn)反彈的現(xiàn)象,因此一般情況下應(yīng)對患者進行較長時間的藥物治療。但是,用藥時間過長會對耐藥突變株的選擇產(chǎn)生影響。拉米夫定作為第一個獲得FDA批準的一個對HBV進行治療的藥物，其剛開始的耐藥率大約為20%左右,而后幾年時間里其耐藥率則呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，約上升到40%～70%左右,已經(jīng)對長期使用拉米夫定產(chǎn)生了嚴重的威脅。到目前為止,任何已經(jīng)上市或者是即將投入使用的核昔(酸)類似物均存在不同程度的耐藥現(xiàn)象[4]。對于一些結(jié)構(gòu)相似，且具有作用機制的相同的藥物之間也會存在交叉耐藥性,這使原本就嚴峻的耐藥問題更加雪上加霜。但是值得安慰的是,阿德福韋作為第二個被FDA予以批準的抗HBV核昔(酸)類似物，其耐藥性不是十分的顯著,并且不會和拉米夫定產(chǎn)生嚴重的交叉性耐藥性；恩替卡韋作為第三個獲的批準的核苷類似物其耐藥性也相對比較輕微,但是還需要對其予以長期的臨床觀察。最近一段時間有文獻曾報道說阿德福韋或者是恩替卡韋是在拉米夫定產(chǎn)生耐藥的基礎(chǔ)上產(chǎn)生治療效果的,阿德福韋或恩替卡韋發(fā)生耐藥的比率要比沒有采用拉米夫定進行治療的患者多很多[5]。

HBV對核苷類似物的耐藥機制主要為以下幾點：HBV聚合酶所涉及的功能范圍主要為:末端蛋白，參與引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄的過程；間隔蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶以及RNaseH。而逆轉(zhuǎn)錄酶的主要功能域有A-G這7個結(jié)構(gòu)域[6]。目前對HBV聚合酶氨基酸序列進行編號采用的是曾經(jīng)有相關(guān)學者所提出的分別對4個功能域進行編號的方法。以下的全部氨基酸序號都對這一編號方法予以了合理的例用。HBV逆轉(zhuǎn)錄酶C域203-206位氨基酸會形成具有保守性的YMDD基序，與一些其它的對RNA產(chǎn)生依賴的聚合酶相同,都是居于酶催化活性中心的一個主要的組成部分。雖然很難對HBV聚合酶進行純化從而獲得晶體的衍射結(jié)構(gòu),然而由于HBV以及HIV等的逆轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出比較明顯的序列同源性關(guān)系,目前已有很多研究小組根據(jù)HIV聚合酶對HBV聚合酶的三維結(jié)構(gòu)模型予以了模擬構(gòu)建。HBV聚合酶也具有“右手構(gòu)象”的特點,同樣是由“拇指”、“掌”以及“手指”這三個亞功能域所組成的。在“掌”部，“手指”以及新加人的dNTP上其催化活性位點會與模板發(fā)生作用?！澳粗浮钡闹饕饔镁褪菍δ０宓亩ㄎ缓玩湹难由爝M行參與。dNTP結(jié)合位點又被稱作是dNTP作結(jié)合口袋，存在于“掌”與“手指”之間[7]。

產(chǎn)生HBV耐藥性發(fā)生突變的主要原因是：任何對RNA產(chǎn)生依賴的聚合酶均不具有顯著的校正功能,也就是指3，-5，外切酶的活性。因此與依賴DNA的聚合酶相比其具有很高的錯配率。在HBV進行復制的周期過程中,對依賴RNA的聚合酶予以了兩次的使用:第一次是存在于宿主細胞的RNA聚合酶Ⅱ自cccDNA進行轉(zhuǎn)錄而得到前基因組RNA；第二次是HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶通過前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄對基因組DNA進行合成。因此,盡管HBV屬于DNA的病毒,但是其發(fā)生突變的概率與其它的DNA病毒性比要高很多。HBV的突變率為在每個復制循環(huán)過程中，每個堿基會有10-4的機會，針對于每毫升的血清病毒載量為1012的病毒粒子的患者而言,HBV的復制率會達到每天1012病毒粒子。對這些理論數(shù)據(jù)進行分析得知，一個患者的體內(nèi)所含的HBV每天幾乎會發(fā)生1000次點的突變。HBV的基因組相對較小，僅為3.2Kb左右，其所具有的ORF均會與其他的ORF發(fā)生重疊。因此，往往1個點的突變會導致多個基因產(chǎn)物也隨之發(fā)生變化[8]。所以，具有高突變率的HBV所引起的大部分的突變體對病毒來說都是有害的，但是只是一部分而已，還是會有一部分的突變是有利的，或者說在某種選擇壓力下是有意義的。相當大的一部分耐藥準種所具有的復制能力要比野生型的低很多，因此在不存在藥物選擇壓力的條件下，耐藥準種的含量相當?shù)纳佟５趯宋?酸)類似物予以應(yīng)用以后，很快耐藥的HBV準種就將其它準種超過了從而占據(jù)了統(tǒng)治的地位。在停藥以后，該統(tǒng)治地位又會重新被野生型所取代。

綜上所述，作為抗HBV藥物核昔(酸)類似物具有一定的治療效果，它們?nèi)詫⒃谝欢〞r期內(nèi)成為對HBV感染進行治療的一個首選藥物。由于人們已經(jīng)比較深入的了解了抗HBV核昔(酸)類藥在臨床的應(yīng)用過程中所產(chǎn)生的耐藥性的機制與規(guī)律，也許能夠通過對不同患者的HBV基因型以及表型進行監(jiān)測從而制定出比較獨特的抗病毒的治療方案，進而使核昔(酸)類藥所具有的抗HBV治療作用能夠得到更好地發(fā)揮。

[1]林向飛,林秀英，韓清錫.拉米夫定對慢性乙型肝炎肝硬化患者的療效觀察[J].中華肝臟病雜志，2009,10(14)：304-306.

[2]金榮華，郎振為，姚光弼，慢性乙型肝炎患者拉米夫定治療后肝組織學的改變[J].中華肝臟病雜志，2008,11(29):555-557.

[3]譚小燕，胡世云.拉米夫定抗慢性乙型肝炎后肝纖維化的療效[J].中華肝臟病雜志，2009,11(12):753-754.

[4]Bartho lomew M M，JansenRW.Jeffers L J.Hepatitis infection after ortho topic liver transp lantaton[J].Lancet,2007，349(9044)：120.

[5]王克霞,王健,張榮波.HBV血清學標志物與PCR HBV DNA檢測結(jié)果的比較[J].錦州醫(yī)學院學報,2009,20(14):232-233.

[6]王健,黃桂珍.聚合酶鏈反應(yīng)檢測慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞內(nèi)和血清中HBV DNA[J].安徽醫(yī)科大學學報,2008,33(13):212-213.

[7]蔡衛(wèi)平,唐小平,陳勁峰,等.慢性乙型肝炎HBV DNA定量檢測與病原標記和肝損害程度的關(guān)系[J].中國實用內(nèi)科雜志,2008,18(13):149-150.

[8]徐風,陳惠蘭,嚴斌,等.肺結(jié)核合并HBV感染患者血清HBV-DNA的檢測及其意義[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2009,18(14):211-212.