龐有旺 鄭季南 洪慶南 方 鈞

（解放軍泉州第180醫(yī)院骨科，泉州 362000）

近年來已經(jīng)證明的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體有三種亞型［1～3］。其中Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體廣泛、互補地分布于大腦皮質(zhì)、丘腦、延髓和脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸能神經(jīng)終末內(nèi)［3～5］。目前已經(jīng)把Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體作為谷氨酸能軸突終末的特異性標識物。生理學研究表明谷氨酸是作用三叉神經(jīng)運動核神經(jīng)元的主要神經(jīng)遞質(zhì)，參與咀嚼、吮吸等活動［6～7］，但有關谷氨酸陽性終末在三叉神經(jīng)運動核的分布模式到目前未見報道。因此，本研究綜合應用束路追蹤與免疫熒光組織化學相結(jié)合技術，對Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體陽性纖維在大鼠三叉神經(jīng)運動核內(nèi)的分布進行了研究。

材料和方法

1.Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光組織化學染色

雄性SD大鼠6只，體重250－280g。戊巴比妥鈉腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，戊巴比妥鈉深麻下，插管至升主動脈，先以100ml 0.025mol/L的PBS沖洗血液，再用500ml含4%多聚甲醛和75%飽和苦味酸的0.1mol/L的PB灌注固定，持續(xù)30min以上。灌畢立即取腦，并置入上述新鮮固定液中后固定4－6h，然后再移腦入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB（pH 7.3）中，至其沉底。冰凍切片機行冠狀切片，片厚25μm，分為2套收集。

第1套切片用于Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光三重染色。具體步驟如下：①小鼠抗神經(jīng)元核蛋白IgG（1∶1000；MAB377；Chemicon）和兔抗Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體IgG（0.8μg/ml，日本京都大學金子武嗣先生惠贈）和豚鼠抗Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體IgG（0.8 μg/ml，日本京都大學金子武嗣先生惠贈）的混合液室溫下孵育過夜；②生物素結(jié)合的驢抗兔IgG（10 μg/ml；Jackson，West Grove，PA）室溫下孵育3 h；③10%兔血清、Alexa647標記的山羊抗小鼠（10 μg/ml；Molecular Probes）、Alexa594標記的驢抗豚鼠IgG （10μg/ml；Molecular Probes）、Alexa488標記的Avidin D（10μg/ml；Molecular Probes）的混合液中室溫下孵育2h?？贵w孵育液如前所述。

第2套切片用于對照實驗。用正常血清替代一抗血清進行免疫熒光組織化學染色，結(jié)果為陰性。

上述染色結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡FV1000，Olympus，Japan）下觀察Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體陽性纖維在三叉神經(jīng)運動核內(nèi)分布（Alexa488的激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長510－525nm；Alexa594的激發(fā)光波長594nm；發(fā)射光波長575－640 nm；Alexa647的激發(fā)光波長647nm，發(fā)射光波長700－720nm。

2.四甲基羅達明束路追蹤結(jié)合Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光組織化學染色

雄性SD大鼠6只，體重250－280g。戊巴比妥鈉腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，手術暴露一側(cè)下頜舌骨肌神經(jīng)，微量注射器抽取2－3μl含10% 的四甲基羅達明水溶液，注入神經(jīng)內(nèi)。動物存活4－5天后，戊巴比妥鈉腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，戊巴比妥鈉深麻下，插管至升主動脈，先以100ml 0.025mol/L的PBS沖洗血液，再用500ml含4%多聚甲醛和75%飽和苦味酸的0.1mol/L的PB灌注固定，持續(xù)30min以上。灌畢立即取腦，并置入上述新鮮固定液中后固定4－6h，然后再移腦入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB（pH 7.3）中，至其沉底。冰凍切片機行冠狀切片，片厚25μm，分為2套收集。

第1套切片用于Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光雙重染色。具體步驟如下：①小鼠抗神經(jīng)元核蛋白IgG（1∶1000；MAB377；Chemicon）和兔抗Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體IgG（0.8μg/ml，日本京都大學金子武嗣先生惠贈）的混合液室溫下孵育過夜；②生物素結(jié)合的驢抗兔IgG（10 μg/ml；Jackson，West Grove，PA）室溫下孵育3 h；③10%兔血清、Alexa647標記的山羊抗小鼠（10 μg/ml；Molecular Probes）、Alexa488標記的 Avidin D（10μg/ml；Molecular Probes，Eugene，OR）的混合液中室溫下孵育2h?？贵w孵育液如前所述。

第2套切片用于對照實驗。用正常血清替代一抗血清進行免疫熒光組織化學染色，結(jié)果為陰性。

上述染色結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡FV1000，Olympus，Japan）下觀察Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體陽性纖維在三叉神經(jīng)運動核內(nèi)分布（Alexa488的激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長510－525nm；四甲基羅達明的激發(fā)光波長568nm；發(fā)射光波長570－610nm；Alexa647的激發(fā)光波長647nm，發(fā)射光波長700－720nm。）

結(jié) 果

神經(jīng)元核蛋白標記的三叉神經(jīng)運動核神經(jīng)元胞體較大，與周圍標記神經(jīng)元對比鮮明，因而整個三叉神經(jīng)運動核邊界清楚（圖A）；Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體標記的神經(jīng)元終末在三叉神經(jīng)運動核背外側(cè)部呈中等密度分布，在三叉神經(jīng)運動核的腹內(nèi)側(cè)部沒有分布（圖B），而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體標記的神經(jīng)元終末在三叉神經(jīng)運動核背外側(cè)部和腹內(nèi)側(cè)部均呈高密度分布（圖C）；在三叉神經(jīng)運動核內(nèi)，未見Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體雙重標記的神經(jīng)元終末，Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體標記的神經(jīng)元終末個體明顯大于Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體標記的神經(jīng)元終末（圖D）。

四甲基羅達明注射入下頜舌骨肌神經(jīng)逆行標記的開口神經(jīng)元聚集于三叉神經(jīng)運動核的腹內(nèi)側(cè)部，與位于三叉神經(jīng)運動核的背外側(cè)部的閉口神經(jīng)元胞體聚集區(qū)界限清楚。此時，我們可以清楚地觀察到在三叉神經(jīng)運動核內(nèi)沒有Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體陽性終末分布的區(qū)域正好是開口神經(jīng)元胞體聚集區(qū)域（圖F）。

討 論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，作為負責轉(zhuǎn)用谷氨酸到囊泡內(nèi)的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體近年引起神經(jīng)科學研究者的關注［1～5］。已經(jīng)有較多形態(tài)學、生理學證據(jù)表明谷氨酸參與調(diào)控咀嚼活動［10～12］，囊泡膜轉(zhuǎn)運體抗體陽性終末在三叉神經(jīng)運動核的分布模式具有重要研究意義。本研究則通過免疫組織化學結(jié)合逆行標記觀察了Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體在三叉神經(jīng)運動核不同區(qū)域的確切分布，我們觀察到Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體在三叉神經(jīng)運動核的閉口神經(jīng)元聚集區(qū)域內(nèi)中等密度分布，在開口神經(jīng)元聚集區(qū)域內(nèi)沒有分布，而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體在整個三叉神經(jīng)運動核內(nèi)均高密度分布。

已往的生理學研究表明從三叉神經(jīng)中腦核到三叉神經(jīng)運動核之間存在直接的單突觸興奮性通路，也存在間接的多突觸興奮性通路，從大腦皮層到三叉神經(jīng)運動核之間只存在間接的多突觸興奮性通路［14～15］。以往的形態(tài)學研究表明三叉神經(jīng)運動核內(nèi)的Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體陽性終末為三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元的中樞突終末［13］。本研究我們觀察到Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體在三叉神經(jīng)運動核不同區(qū)域差異分布，其中一個顯著特征就是在三叉神經(jīng)運動核的腹內(nèi)側(cè)區(qū)未見Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體陽性終末分布，我們進一步逆行標記了開口神經(jīng)元，明確三叉神經(jīng)運動核內(nèi)沒有Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體陽性終末分布的區(qū)域為開口神經(jīng)元區(qū)。因而，本研究結(jié)果表明Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體在三叉神經(jīng)中腦核到閉口神經(jīng)元間的單突觸反射通路中發(fā)揮作用，而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體則在大腦皮層或三叉神經(jīng)中腦核等核團到三叉神經(jīng)運動核開口和閉口神經(jīng)元的多突觸通路中發(fā)揮作用。

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