劉 涓 王 赟 張端蓮

（1武漢大學人民醫(yī)院老年病科，武漢 430060；2中國人民解放軍95825部隊醫(yī)院 湖北432111；3武漢大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，武漢430071）

皮膚血管瘤是嬰幼兒時期常見的一種良性腫瘤，其發(fā)生率約為1%－12%不等［1－2］。雖然皮膚血管瘤是一種良性腫瘤，但其病理變化主要是由于血管內(nèi)皮細胞異常增殖，因此有部分皮膚血管瘤生長迅速，可引起容貌缺陷和局部畸形，往往給患者及其家人帶來極大痛苦，但關于血管瘤的發(fā)病機制，目前還沒有明確的說法，因此對于皮膚血管瘤的臨床治療也是目前急待解決的關鍵問題。

多梳基因家族（PcG）具有高度保守性，除能抑制其下游靶基因轉錄外［3］，還能調(diào)節(jié)干細胞自我更新，參與細胞分化，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生及干細胞維持中發(fā)揮重要作用［4－6］。Bmi－1、EZH2 同 屬 于PcG家族，并在PcG家族中起核心作用。

本文應用免疫組織化學方法和圖像分析技術檢測了血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中Bmi－1和EZH2的表達水平，探討B(tài)mi－1和EZH2在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，為臨床上治療血管瘤提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來源

收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2008年－2011年皮膚毛細血管瘤存檔蠟塊40例，其中男性15例，女性25例。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等?；颊咝g前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組

將所有標本進行免疫組織化學S－P法檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分類標準并結合PCNA的表達進行分組：石蠟標本中增生期血管瘤22例，退化期血管瘤18例。另取距瘤組織5cm外的周圍正常皮膚組織5例作對照。

1.3 主要試劑

即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人Bmi－1和EZH2單克隆抗體（購于北京中杉生物技術有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒（購于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購于北京中杉生物技術有限公司）。

2方法

2.1 免疫組織化學SP法檢測Bmi－1、EZH2和PCNA相關抗原

具體步驟：（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復（檸檬酸緩沖液微波抗原修復法）；（3）滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗（PCNA：1：100；Bmi－1：1：200；EZH2：1：150）；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為Bmi－1和EZH2的陽性對照組，人正常皮膚表皮作為PCNA的陽性對照組。

2.2 免疫組織化學結果判斷

（1）Bmi－1和EZH2都是以細胞核或胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應，PCNA以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對Bmi－1和EZH2的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積×100%）

2.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗，檢驗水準α為0.05。

結 果

1.PCNA的表達

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞核肥大，核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達強（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞核扁平，胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA表達弱（圖2）。

2.Bmi－1的表達

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞核或胞質內(nèi)有較多棕黃色顆粒，Bmi－1呈高表達（圖3）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞胞核或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，Bmi－1呈低表達（圖4）；正常皮膚組織內(nèi)皮細胞核或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，Bmi－1呈低表達（圖5）。圖像分析結果見表1。增生期組Bmi－1的表達明顯高于退化期組和正常皮膚組織組（P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 增生期血管瘤PCNA的表達 增生的內(nèi)皮細胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒（→），PCNA表達強，S－P×400Fig.1 PCNA expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in the nucleus of proliferating endothelial cells，which showed PCNA expressed strongly（→）.S－P×400

圖2 退化期血管瘤PCNA的表達 內(nèi)皮細胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），PCNA表達弱，S－P×400Fig.2 PCNA expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in the nucleus of less endothelial cells，which showed PCNA expressed weakly（→）.S－P×400

圖3 增生期血管瘤Bmi－1的表達 內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），Bmi－1表達強，S－P×400Fig.3 Bmi－1expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，Bmi－1expressed strongly（→）.S－P×400

圖4 退化期血管瘤Bmi－1的表達 內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），Bmi－1表達弱，S－P×400Fig.4 Bmi－1expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，Bmi－1expressed weakly（→）.S－P×400

圖5 正常對照組Bmi－1的表達 內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），Bmi－1表達弱，S－P×400Fig.5 Bmi－1expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，Bmi－1expressed weakly（→）.S－P×400

圖6 增生期血管瘤EZH2的表達 血管瘤內(nèi)皮細胞核或胞質內(nèi)有較多棕黃色顆粒（→），EZH2表達強，S－P×400Fig.6 EZH2expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，EZH2expressed strongly（→）.S－P×400

圖7 退化期血管瘤EZH2的表達血管瘤內(nèi)皮細胞胞核或胞質內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達弱或無表達（→），S－P×400Fig.7 EZH2expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，EZH2expressed weakly（→）.S－P×400

圖8 正常組EZH2的表達 血管內(nèi)皮細胞胞核或胞質內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達弱或無表達（→），S－P×400Fig.8 EZH2expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，EZH2expressed weakly（→）.S－P×400

表1 血管瘤不同時期Bmi－1表達的平均光密度和陽性面積率（xˉ±s）Table1 The average optical density and the rate of Bmi－1positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（xˉ±s）

3.EZH2的表達

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞核或胞質內(nèi)有較多棕黃色顆粒，EZH2表達強（圖6）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞胞核或胞質內(nèi)有較少棕黃色顆粒，EZH2表達弱（圖7）；正常皮膚組織內(nèi)皮細胞核或胞質內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，EZH2表達弱（圖8）。圖像分析結果見表2。增生期血管瘤內(nèi)皮細胞EZH2的表達顯著低于退化期血管瘤內(nèi)皮細胞和正常組織 （P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 血管瘤不同時期EZH2表達的平均光密度和陽性面積率（±s）Table2 The average optical density and the rate of EZH2positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（±s）

表2 血管瘤不同時期EZH2表達的平均光密度和陽性面積率（±s）Table2 The average optical density and the rate of EZH2positive area of in differ period of human dermal hemangiomas（±s）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常皮膚組比較，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮膚組與增生期組比較，P＜0.05（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

組別Group例數(shù)N平均光密度Average Optical Density陽性面積率Rate of Positive Area增生期組Proliferating Group 22 0.2543±0.0157＊ 0.2993±0.0186＊退化期組Involuting Group 18 0.1547±0.0127△ 0.1549±0.0169△正常皮膚組 Normal Skin Group 5 0.1287±0.0116▲ 0.1383±0.0155▲

討 論

血管瘤的自然病程包括增生期、退化期和退化完成期三個階段。目前血管瘤的發(fā)病機制還不完全清楚［7－9］，盡管多數(shù)血管瘤本身不會危及生命，且可能隨著年齡增長有消退趨勢，然而由于血管瘤的生長往往不同于一般良性腫瘤，在早期特別是在1歲以內(nèi)具有生長迅速的特點，部分血管瘤可向周圍組織呈浸潤性生長，而且它的發(fā)病部位大多位于頭面部體表部位［3］，所以它不僅僅可引起容貌缺陷和局部畸形，還往往給患者及其家人帶來極大的精神壓力和心理負擔，此外還有少部分血管瘤因潰爛、感染、出血、阻塞或壓迫重要組織器官而加重損傷，甚至可能發(fā)生嚴重的危及生命的并發(fā)癥。目前關于治療血管瘤方法的成效并不十分顯著，一些治療模式的顯著副作用也限制了其應用。因此探討皮膚血管瘤的發(fā)病機制對臨床上治療血管瘤有著重要的意義。

原癌基因 Bmi－1（B－cell specificMo loney murineleukem ia virus insertion site 1）它屬于polycomb家族，直接參與細胞生長、增殖的調(diào)節(jié)［10］。研究證實人類多種腫瘤，如白血病、乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌及食管癌等的發(fā)生、發(fā)展過程均與 Bmi－1基因表達異常有關［11－13］。

在生物體生長發(fā)育過程中，PcG蛋白是基因調(diào)控決定細胞命運的組成部分，通過形成巨大的多目標復合物，作用在染色體上的不同位點，致使染色體變構，從而調(diào)控基因的表達［14］。PcG蛋白的主要作用目標是Homeotic基因簇，hox基因在決定細胞的定向分化與增殖，以及調(diào)控機體組織器官的發(fā)育方面起決定性作用。因此，PcG基因，如Bmi－1、Pc2、Cbx7、EZH2的失調(diào)與癌細胞的異常增殖密切相關［15］，其中的Bmi－1基因與EZH2一起通過形成多蛋白復合體維持hox的抑制狀態(tài)。

Breuer等在研究支氣管鱗癌及癌前病變中Bmi－1表達的相關機制中發(fā)現(xiàn)，癌前病變及癌組織中的Bmi－1表達明顯高于正常組織，同時伴有P16的低表達EZH2表達增強，推測EZH2可能為Bmi－1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個重要中介產(chǎn)物［16］。

本研究結果顯示：在增生期血管瘤組織中Bmi－1、EZH2蛋白表達明顯高于正常組織，提示Bmi－1、EZH2基因可能通過調(diào)節(jié)細胞周期參與了血管瘤的增生過程。同時發(fā)現(xiàn)Bmi－1與EZH2蛋白的表達呈正相關，提示Bmi－1和EZH2蛋白可能共同促進了血管瘤的發(fā)生和發(fā)展，推測其機制可能是兩者都抑制HOX基因的轉錄，通過調(diào)控細胞周期、抑制細胞分裂、阻止細胞凋亡等來共同促進血管瘤的發(fā)生發(fā)展，但具體機制尚不明確，有待進一步探討。

［1］Jinnin M，Ishihara T，Boye E，et al.Recent progress in studies of infantile hemangioma.The Journal of Dermatology，2010，37（4）：283－298

［2］Cm W，A T，C G.HLA system and embryo development.Reprod Biomed Online，2002，4（2）：133－139

［3］Ringrose L，Paro R.Epigenetic regulation of cellu－larmemory by thepolycomb and trithorax group proteins.Annu RevGenet，2004，38（11）：413－443

［4］Jacobs JJ，Kieboom K，Marino S，et al.The oncogene and Polycomb－group gene bmi－1regulates cell proliferation and senescence through the ink4alocus.Nature，1999，397（6715）：164－168

［5］Weikert S，Christoph F，Kollermann J，et al.Expression levels of the EZH2polycomb transcriptional repressor correlate with aggressiveness and invasive potential of bladder carcinomas.Int J Mol Med，2005，16（2）：349－353

［6］Jacobs JJ，Scheijen B，Voncken JW，et al.Bmi－1collaborates with c－Myc in tumorigenesis by inhibiting c－Mycinduced apoptosis via INK4a/ARF.GenesDev，1999，13（20）：2678－2690

［7］Ito T，Ito N，Saathoff M，et al.Immunology of the Human Nail Apparatus：The Nail Matrix Is a Site of Relative Immune Privilege.J Investig Dermatol.2005，125（6）：1139－1148

［8］Blaschitz A，Lenfant F，Mallet V，et al.Endothelial cells in chorionic fetal vessels of first trimester placenta express HLA－G.Eur J Immunol.1997，27（12）：3380－3388

［9］Jurisicova A，Casper R F，Maclusky N J，et al.HLA－G expression during preimplantation human embryo development.Proc Natl Acad Sci USA.1996，93（1）：161－165

［10］Zhi zhong L，Ru Cao，Ming Wang，et al，Structure of a Bim－1－Ring1BPolycomb Group Ubiquitin Ligase Com－plex.J Biological Chemistry，2006，281（29）：20643－20649

［11］Hga K，Ohno S，Yugawa T，et al.Efficient immortalization of primary human cells by p16INK4a－specific short hairp in RNA or Bmi－1，combined with introduction of Htert.Cer Sci，2007，98（2）：147－154

［12］Kang MK，Kim RH，Kim SJ，et al.Elevated Bmi－1 expression is associated with dysplastic cell transformation during oral carcinogenesis and is required for cancer cell replication and survival.Br J Cancer，2007，96（1）：126－133？

［13］Lee K，Adhikary G，Balasubramanian S，et al.Expression of Bmi－1in epiderm is enhances cell survivalby altering cell cycle regulatory prote in expression and inhibiting apoptosis.J Invest Dermatol，2008，128（1）：9－17

［14］Gil J，Bernard D，PetersG.Role of polycomb group proteins in stem cell self－renewal and cancer.DNA Cell Biol，2005，24（2）：117－125

［15］FrankM，Raaphorst，F(xiàn)olkert J，et al.Coexpression of BMI－1and EZH2polycomb group genes in Reed－Sternberg cells ofHodgkin＇s disease.Am J Pathol，2000，157（3）：709－715

［16］Breuer RH，Snijders PJ，Sutedja GT，et al.expression of thep16（INK4a）geneproduct，methylation of the p16（INK4a）promoter region and expression of the polycombgroup gene BMI－1in squamous cell lungcarcinom a and premali－gnanten dobronchial lesions.Lung Cancer，2005，48（3）：299－306