畢承華

桔梗是中國傳統(tǒng)的草藥，它的免疫刺激效果和抗腫瘤效果是眾人皆知的。Lee用體外和體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實驗檢驗了桔梗根水提取物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性［1］。CK通過一個再生的基底細胞膜抑制了B16-F10黑色素瘤細胞，并強烈抑制B16-F10黑色素瘤細胞黏附到細胞外基質(zhì)，例如基質(zhì)膠，纖維結(jié)合蛋白和層粘連蛋白底物。CK也抑制了實驗性肺癌并延長了體內(nèi)幸存時間。除此之外，CK擴大了NK細胞活性。這些結(jié)果表明了CK可能通過抑制腫瘤細胞黏附到基底細胞膜和激活NK細胞而減少B16-F10黑色素瘤細胞肺轉(zhuǎn)移的程度。

桔梗的根既可食用又可作為傳統(tǒng)的藥物治療成年疾病，例如支氣管炎、哮喘、肺結(jié)核、高脂血癥和炎性疾病，也作為鎮(zhèn)靜劑使用。近來，有人工栽培20年的桔梗中提取的成分changkil(CK)在大鼠身上具有抗氧化、保肝和阻止肝纖維化作用的報道。除此之外，通過Toll-like4受體樣作用它也可以激活巨噬細胞。雖然CK通過調(diào)控巨噬細胞功能具有擴大免疫反應(yīng)的作用，但是細胞介導(dǎo)的精確免疫擴增機制卻是不清楚的。此外，CK其他的生物學(xué)特性，例如對于腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚。經(jīng)過以下研究，除調(diào)查CK的抗腫瘤活性，關(guān)于瘤轉(zhuǎn)移的治療抑制作用之外，還分析了CK抗瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)的機制，探討CK是否通過激活自然殺傷細胞而增強了宿主防御系統(tǒng)抑制腫瘤。這項結(jié)果在于證明其在小鼠實驗中有重要的抗轉(zhuǎn)移活性［2］。

1 實驗研究

采用每分轉(zhuǎn)數(shù)為1640的介質(zhì)培養(yǎng)基和購置的胎牛血清、從分子探針技術(shù)中得到的鈣黃綠素-AM，制備了22年生桔梗根的水提取物進行了實驗研究。方法是，向蒸餾水中加入粉末狀根(5 ml/g)，該混合物在90℃保持10 h，冷卻至室溫，然后濾過和低壓凍干，吸收率約是33.5%(每100 g原干燥根中含有33.5 g剩余殘渣)，將得到的淺黃色水提取物(CK)直接溶解在滅菌生理鹽水中。

采用的動物為Dao Han動物研究公司提供的5～6周大成年雄性小鼠，用嚙齒類動物專用飼料飼養(yǎng)，飲水量不限，飼養(yǎng)環(huán)境為(21±2)℃，(50±5)%相對濕度，有12 h晝夜交替的條件。

所采用的細胞株為具有高度侵害和轉(zhuǎn)移能力的鼠類黑色素瘤B16-F10，和鼠類淋巴瘤YAC-1(自然殺傷敏感靶細胞)，被保存在含 10%FBS，100 μnits/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素，RPMI1640培養(yǎng)液中，以37℃，含經(jīng)濕化的5%CO2的環(huán)境保存。

應(yīng)用經(jīng)改良的在Transwell細胞培養(yǎng)真空箱中進行的腫瘤細胞體外侵潤分析法檢測活性。方法為:將8.0 μm孔徑的聚乙烯吡咯烷酮-游離聚碳酸酯過濾器用500 μg/ml的基質(zhì)膠包埋后置Transweil真空室內(nèi)。過濾膜在磷酸鹽緩沖液(pbs)中沖洗后立即干燥。10%FBS-RPMI1640培養(yǎng)液放在室中低位，B16-F10細胞被放在室中高位。將CK溶液加到高位，在37℃含有5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h。通過0.2%結(jié)晶紫染色計數(shù)法測量穿過PVPF過濾膜基質(zhì)膠包埋侵潤的細胞數(shù)量。

通過96孔板，使用以往方法的改良法進行細胞黏附測定。小孔預(yù)先在室溫下用 50 μl，15 μg/ml纖維結(jié)合素，10 μg/ml基質(zhì)膠，或 50 μl，40 μg/ml層黏連蛋白包埋，然后用0.2 mlRPMI1640/well(包含3%BSA)，培養(yǎng)液在37℃密封1 h。把細胞放在RPMI1640(包含0.1%BAS)培養(yǎng)液中重新懸浮，加入每個孔池中(5×105/ml)，然后加入CK，充分反應(yīng)。將該混懸液在37℃下培養(yǎng)1 h。小孔池用加熱的磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗兩次以除去未反應(yīng)的細胞，已反應(yīng)的細胞在20%甲醇中用0.2%龍膽紫水溶液染色10 min。細胞染色后，立即在200 μl1%十二烷基磺酸鈉中溶解，光密度在560 nm用(microplate reader)全自動定量繪圖酶標儀可以測量。

進行了細胞毒性實驗，用WST-1細胞計數(shù)器測定細胞生長的水平。簡言之，把10%FBS-RPMI1640培養(yǎng)液中的B16-F10細胞分放在有96個小孔池中，培養(yǎng)24 h后，把各種不同濃度的CK加到池中，37℃下再培養(yǎng)24 h。鹽酸阿霉素用于抑制對照。把10 μl WST-1溶液加入到每個孔池中，在37℃下培養(yǎng)4 h，然后結(jié)束實驗。450 nm處的吸光度可以用(microplate reader)全自動定量繪圖酶標儀測定。

1.1 實驗性肺轉(zhuǎn)移體內(nèi)測定 采集B16-F10對數(shù)生長細胞，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液清洗，混懸，使其在磷酸鹽緩沖液中具有適宜的濃度。將C57BL/6小鼠隨機分成3組，每組有12只，3個組均尾靜脈注射B16-F10細胞混懸液，每次0.2 ml(5×105)。將CK混懸于滅菌生理鹽水中，然后用這種轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)作用以口服方式持續(xù)不斷地喂給小鼠。這種治療持續(xù)7 d。1組僅被注射B16-F10細胞混懸液所采用的賦形劑，2組與3組分別以20 mg/kg和100 mg/kg劑量注射CK，每天監(jiān)測動物體重，將每組中的6只小鼠注射腫瘤細胞14 d后處死，將肺臟保存于Bouin's溶液(苦味酸∶20%福爾馬林中性緩沖液∶乙酸=15∶5∶1)中。用立體解剖顯微鏡觀察每組小鼠肺表面的B16-F10菌群數(shù)量，測定它們的存活率。需監(jiān)測存活率兩個月以上。

1.2 脾淋巴細胞的分離 將CK放在滅菌生理鹽水中混懸并以口服方式喂小鼠3 d。該分離方法為以往常用的方法。細胞的成活率總是大于90%。

1.3 自然殺傷細胞活性實驗 NK細胞活性可以通過形成鈣黃綠素-Am釋放分析來測定，這種方法是對曾報道過方法的改良。用10 μg/ml的鈣黃綠素在游離血清-培養(yǎng)液中對YAC-1細胞標記30 min，用純RPMI1640培養(yǎng)液清洗三次后，把0.1 ml標記YAC-1細胞加到96孔板中。將效應(yīng)器細胞，脾淋巴細胞(0.1 ml)加到每個小孔池中來產(chǎn)生各種效應(yīng)因子/靶因子比例，小孔板在37℃下培養(yǎng)4個 h，離心后，移除0.1 ml游離細胞上清液，用熒光光度計測量上清液的熒光強度，其在500nm有最大吸光強度，540 nm有最大發(fā)光強度。特有的細胞溶解活性按照如下方法計算:百分細胞溶解活性=(E-S)(T-S)×100(E是靶細胞和效應(yīng)細胞的熒光吸收強度，S僅是靶細胞的熒光發(fā)射強度，T是總的熒光強度)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果以均值±標準差表示，組間差異用方差分析表，檢驗是否兩組間存在較大的偏差，Dunnet檢驗用于比較兩組之間的平均值。余下數(shù)據(jù)用Fisher精密度檢驗和卡普蘭-邁耶生存曲線進行分析。若P＜0.01則在差異上有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 實驗結(jié)果如下 CK在腫瘤細胞侵潤方面的作用具有高侵潤和轉(zhuǎn)移能力的鼠類黑色素瘤細胞群(B16-F10)進行體外侵潤實驗的結(jié)果表明，在Transwell細胞培養(yǎng)室中CK對侵潤重建基底膜(基質(zhì)膠)的B16-F10細胞有抑制作用。CK抑制B16-F10細胞侵潤基質(zhì)膠/纖維結(jié)合蛋白-包埋過濾膜的作用呈現(xiàn)濃度依賴方式，濃度約為20 μg/ml的CK濃度可以抑制50%細胞。

CK在腫瘤細胞與ECM黏附方面的作用可以測定出CK對B16-F10細胞黏附ECM組分的作用，因為腫瘤細胞與ECM的黏附作用是腫瘤侵潤作用中最基本的一步。將B16-F10細胞用濃度1～100 μg/mlCK進行處理，CK可以抑制B16-F10黑色素瘤細胞與基質(zhì)膠(IC50=43 μg/ml)和纖維結(jié)合蛋白(IC50=62 μg/ml)黏附，該作用是呈現(xiàn)濃度依賴方式。CK強烈地抑制B16-F10細胞與層黏連蛋白結(jié)合，濃度是31 μg/ml的CK呈現(xiàn)最大抑制細胞黏附作用。在下面一系列的實驗中進一步測定了CK抑制B16-F10細胞與層黏連蛋白底物結(jié)合的機制。用濃度為1-100 μg/mlCK在冰上培養(yǎng)B16-F10細胞1 h，然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)培養(yǎng)。在另外的實驗中，包埋的層黏連蛋白底物在37℃下培養(yǎng)3 h，用PBS液清洗。表明CK阻礙B16-F10細胞與層黏連蛋白黏附呈現(xiàn)濃度依賴的方式。然而，用CK對底物沒有這樣的抑制作用。

CK對B16-F10黑色素瘤細胞的細胞毒性效應(yīng)WST分析以檢測CK的抗黏附作用是否由基于細胞毒性的假陽性作用引起。CK在1-100 μg/ml范圍內(nèi)無影響對B16-F10細胞24 h培養(yǎng)中的生長。另一方面，鹽酸阿霉素作為陽性對照，對體外細胞生長有潛在的抑制作用。CK濃度超過800 μg/ml顯示有輕細胞毒性作用(數(shù)據(jù)沒有表明)。這些結(jié)果說明CK對腫瘤細胞黏附和侵潤作用不是由于CK的細胞毒性作用。

2 CK對肺轉(zhuǎn)移和存活率的影響

因為上面的結(jié)果闡釋CK在體外實驗中對腫瘤侵潤有顯著的抑制作用，這項研究檢測CK在體內(nèi)實驗對肺轉(zhuǎn)移的影響，通過給C57BL/6小鼠靜脈注射B16-F10黑色素瘤細胞產(chǎn)生肺轉(zhuǎn)移酶，結(jié)果顯示用CK處理過的小鼠肺轉(zhuǎn)移酶數(shù)量與未處理的比較呈現(xiàn)CK濃度依賴型減少。尤其，用100 mg/kg濃度CK處理小鼠可以抑制65%的肺轉(zhuǎn)移數(shù)量。在這個劑量下，不但對小鼠體重沒有影響，也沒有任何其他毒性臨床癥狀。這些結(jié)果闡釋了CK口服有劑量依賴型抗轉(zhuǎn)移活性。100 mg/kg劑量處理小鼠后存活期高于對照組二倍多。

2.1 CK對體內(nèi)NK細胞活性的影響 CK對先天宿主反應(yīng)的作用機制可被檢測，尤其是NK細胞擴增，因為同時給與CK在阻止腫瘤轉(zhuǎn)移是有效的。NK細胞的擴增表明具有抑制瘤轉(zhuǎn)移的作用。在此項研究中，CK連續(xù)3 d給藥后，用脾淋巴細胞作效應(yīng)細胞，YAC-1細胞做靶細胞檢測一天NK細胞的活性。結(jié)果表示CK以劑量依賴的方式顯著的提高脾NK細胞活性。脾淋巴細胞活性被增加的同時，注射CK 3 d后NK細胞活性達到最高。因此，CK可以激活體內(nèi)NK細胞的活性。該研究表明CK以劑量依賴的方式較強地抑制肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移由注射B16-F10黑色素瘤細胞產(chǎn)生。

3 結(jié)論

腫瘤細胞侵潤細胞外基質(zhì)是瘤轉(zhuǎn)移過程中重要的一步。細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)通過與細胞表面受體結(jié)合促進細胞黏附。這個研究表明使用重建基底膜(體外基質(zhì)膠)，CK可以抑制B16-F10細胞侵潤。一項體外黏附實驗說明CK成功地阻礙了B16-F10黑色素瘤細胞黏附于細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，例如基質(zhì)膠，纖維結(jié)合蛋白和層黏連蛋白，該一致作用呈現(xiàn)濃度依賴的方式。用CK短期預(yù)處理B16-F10細胞可阻礙細胞黏附于層黏連蛋白，該事實說明抑制細胞黏附于層黏連蛋白底物與CK和腫瘤細胞表面結(jié)合有關(guān)而并非與層黏連蛋白底物有關(guān)。然而，詳細的機制仍不清楚。一個可能的解釋是CK與層黏連蛋白的受體(例如在腫瘤細胞表面的一種抗抑郁藥)結(jié)合，這種結(jié)合使CK抑制了腫瘤細胞的黏附與侵潤。24 h的培養(yǎng)過程中，CK在研究所使用的濃度下未顯示任何的細胞毒性反應(yīng)。這表明CK的抗黏附和抗侵潤作用不是由于細胞毒性產(chǎn)生的。許多報道說明生物活性化合物的抗腫瘤活性通過刺激免疫系統(tǒng)與不同的源物質(zhì)分離開來。從當(dāng)歸屬中分離出來的當(dāng)歸和青牛膽屬考狄葉素增強了B16-F10黑色素瘤細胞植入小鼠的免疫功能，并增加了這些鼠的生存率，同時也抑制了細胞瘤轉(zhuǎn)移。Song報道了人參的免疫刺激和抗腫瘤作用［3］。這些報道表明來自天然資源的免疫刺激活性物質(zhì)是研發(fā)抗腫瘤藥物很好的候選物質(zhì)。許多實驗和臨床研究表明先天免疫性在免疫監(jiān)視和阻斷原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。體外長期和短期實驗都表明CK既不會對腫瘤細胞產(chǎn)生毒性也不會抑制細胞增殖。這些結(jié)果也暗示在減少CK處理過動物瘤轉(zhuǎn)移過程中，也涉及到了免疫系統(tǒng)。進一步講，腫瘤減少也可能是通過β-細胞或非特異性免疫細胞(例如NK細胞)介導(dǎo)的，因為CK選擇性的激活B細胞和巨噬細胞，但不能激活T細胞。這些結(jié)果說明，CK可能調(diào)節(jié)了先天宿主防御系統(tǒng)機制。除此之外，對抗腫瘤自然免疫系統(tǒng)相關(guān)的效應(yīng)器也被確認為是NK細胞。實際上，許多研究者已經(jīng)報道了免疫興奮劑激活NK細胞導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移減少。事實上，腫瘤發(fā)病率和轉(zhuǎn)移在小鼠身上是高發(fā)的。除此之外，據(jù)報道鄰-半乳糖?；拾贝伎梢栽黾芋w內(nèi)NK細胞的數(shù)量，也可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移酶。因此，更有效力的NK擴增劑具有潛在的抗腫瘤活性，但是目前適合的分子靶點還沒有確定。因此，這項研究依據(jù)NK細胞的激活作用分析了CK抑制瘤轉(zhuǎn)移的機制。CK顯著地增強了體內(nèi)NK的活性。

總之，Lee的實驗證明了CK在體外和體內(nèi)均顯示出了抗瘤轉(zhuǎn)移效應(yīng)［3］。這些結(jié)果表明CK的抗轉(zhuǎn)移活性可能是由于阻斷了NK細胞抗癌時的黏附和擴增。但是CK抗腫瘤活性是否是由于在體內(nèi)阻斷了一種抗抑郁藥integrin介導(dǎo)的黏著作用需要更進一步的研究。CK對于改善腫瘤侵潤和尋找轉(zhuǎn)移治療方法可能會提供一個潛在的平臺，它尤其適合于手術(shù)后腫塊的清除和癌癥的復(fù)發(fā)治療。

［1］Lee，E.B.，1973.Phanmacological studies on Platycodon grandiforum A.DC.IV.A comparison of experimental pharmacological efxcts of crude platycodin with clinical indications of piatycodi radix.Yak-ugaku Zasshi93，1188-1194.

［2］Lee，K.，J.，Jeong，H.G.，2002Protective efoct of platycodi radix on carbontetrachloridc-induced hepatotoxicity.Chem Toxicol.40:517-525.

［3］SongJ.Y.，Han，S.K.，Son，E ＞ H.，Pyo，S.N.，Yun，Y.S.，Yi，S.Y.，2002，Induction of sceretory and tumorieidal aetivities in peritoncal macro-phages by ginsan. Int. Immunopharmaeol.2:857-865.