盧金鳳，蒲旭峰，閔志強(qiáng)，李亞麗，楊奎

自百年前出現(xiàn)注射用藥至今，非腸道用醫(yī)用制品中的熱原對人體的危害已經(jīng)人所共知，臨床表現(xiàn)如下：發(fā)熱，寒顫，惡心，嘔吐，頭痛，腰及關(guān)節(jié)痛，膚色灰白，白細(xì)胞下降，血管通透性增強(qiáng)，嚴(yán)重者造成昏迷甚至休克，死亡。因此要求非腸道使用制品包括藥品、生物制品（包括基因工程產(chǎn)品和基因治療相關(guān)產(chǎn)品）和醫(yī)療器械裝置（體內(nèi)用）都應(yīng)進(jìn)行熱原檢測，有效地對其熱原進(jìn)行控制和檢查是臨床上安全使用的重要保證。通過使用健康人體全血分離得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行熱原檢測，可真實(shí)地模擬機(jī)體對熱原的反應(yīng)，更好的保證了制劑的安全性。

1 熱原本質(zhì)

到目前為止國內(nèi)外對熱原的定義還沒有一個(gè)統(tǒng)一的認(rèn)識[1]，一般認(rèn)為熱原是指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。引起機(jī)體致熱反應(yīng)的物質(zhì)稱為熱原質(zhì)[2]。熱原的本質(zhì)特征是造成機(jī)體發(fā)熱。主要分為兩大類：

（1）外源性熱原:微生物來源：細(xì)菌（內(nèi)毒素），病毒，蛋白，熱體蛋白等非微生物來源：抗原-抗體復(fù)合物，膽酸，本膽烷酮醇[3～4]等。

（2）內(nèi)源性熱原:激素類：類固醇，前列腺素細(xì)胞因子：IL-6，IL-1β ，TNF-α 。

2 熱原發(fā)熱機(jī)理

目前關(guān)于熱原致熱的主要觀點(diǎn)是：幾乎所有的外源性發(fā)熱物質(zhì)均通過刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子而最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱。首先是外源性熱原進(jìn)入機(jī)體后刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性熱原如IL-6、TNF、IL-1等細(xì)胞因子，這些因子通過終板血管器[5]直接或間接進(jìn)入下丘腦視前區(qū)等中樞系統(tǒng)后，一方面升溫介質(zhì)和神經(jīng)整合作用使體溫上升，另一方面又通過內(nèi)源性解熱物質(zhì)作用腹中膈（VSA）和中杏仁核（MAN）等體溫負(fù)調(diào)節(jié)中樞限制體溫升高[6]。

3 目前檢測熱原的方法

3.1 家兔檢測法

家兔法檢測熱原的基本操作為：將藥品靜脈注射入家兔體內(nèi)后，測其體溫升高幅度，以此來判斷熱原的有無[7]。家兔法檢測熱原能很好地反映各種熱原致熱程度，但不能定量反映熱原含量，不易標(biāo)準(zhǔn)化，并且存在種屬差異[8]，個(gè)體差異[9]較大，造成結(jié)果重復(fù)性差等。

3.2 細(xì)菌內(nèi)毒素法（BET）

1956年Bang[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌懸液與鱟血細(xì)胞溶解產(chǎn)物會產(chǎn)生凝聚，1968年，Liven和Bang[11]以此為原理，建立起鱟試驗(yàn)法，即細(xì)菌內(nèi)毒素法。細(xì)菌內(nèi)毒素法檢測熱原的基本原理為：利用細(xì)菌內(nèi)毒素可與鱟試劑特異性反應(yīng)，可限量和定量檢測內(nèi)毒素含量[7]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測熱原法靈敏度高，允許半定量或全定量檢測細(xì)菌內(nèi)毒素，但只能特異性地檢測細(xì)菌內(nèi)毒素，并且用BET 方法檢查通過, 但卻引起了臨床熱原反應(yīng)[12]，表明細(xì)菌內(nèi)毒素并非唯一的致熱物質(zhì)。并且鱟作為一種遠(yuǎn)古生物，因其不合理利用瀕臨滅絕。

3.3 體外熱原檢測法

新的熱原實(shí)驗(yàn)方法為Duff和Akins（1982）[13]和Dinarello（1984年）[14]提出，他們利用人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。至今多種檢測系統(tǒng)不斷被提出。

現(xiàn)在出現(xiàn)的新方法按細(xì)胞來源不同可分為三類：白細(xì)胞系法，人外周血單個(gè)核細(xì)胞法(PBMC法)[15～16]、人全血法[17～18]。國外對新方法的研究始于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過相關(guān)學(xué)者近30年的研究，目前已有7種方法（新鮮人全血IL-1β 、新鮮人全血-IL-6、PBMC-IL-6、MM6-IL-6、THP1-新喋呤、THP1-TNF-α 、凍存人全血-IL-1 ）分別于2004、2005年獲得歐洲權(quán)威機(jī)構(gòu)（包括歐洲替代方法論證中心，英國國家生物制品檢定所）的正式論證。

體外熱原檢測新方法的優(yōu)缺點(diǎn)：①可以很好的反映人體對熱原的反應(yīng)；②相關(guān)性好，重復(fù)性好；③檢測方法相對家兔法簡便，不需要使用動物；④操作均需在無菌條件下完成，對實(shí)驗(yàn)室要求高；⑤基本為人血或動物血液，對血液來源安全性存在疑問。

4 PBMC法檢測熱原

4.1 PBMC發(fā)展概況

PBMC法是細(xì)胞法中發(fā)展得較為成熟的方法，目前已被歐洲藥典收載[19]。人外周血單個(gè)核細(xì)胞(簡寫為PBMC)不是單一細(xì)胞，它包含了人外周血中的各種免疫細(xì)胞，約12%為單核細(xì)胞，88%為淋巴細(xì)胞[20]。人血中能分泌免疫細(xì)胞因子的各主要細(xì)胞都包含其中。

人體對熱原的反應(yīng)是多種免疫細(xì)胞參與作用的結(jié)果，只用一種細(xì)胞并不能完全真實(shí)地模擬機(jī)體對熱原的反應(yīng)，而PBMC則克服了這個(gè)不足之處，因此該方法在可靠性上要優(yōu)于其他單核／巨噬細(xì)胞法。Stephen Poole[16]，Anthony F.Suffredini[21]對該方法進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞因子分泌狀況與人體發(fā)熱的真實(shí)體內(nèi)細(xì)胞因子分泌狀況基本一致，該方法對細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測限可達(dá)0.015 EU﹒mL-1。2005年召開的新熱原檢測方法國際論證會議上，對PBMC法的主要論證結(jié)果如下：該方法在3個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的重復(fù)性分別為94.4% ，100% ，94.4% ；在3個(gè)實(shí)驗(yàn)室的再現(xiàn)性分別為80.6% ，86.1% ，88.9% ；方法能夠識別熱原陽性和陰性產(chǎn)品的準(zhǔn)確性分別為92.2% ，95% ，而家兔法只有57.7% ，88.3%[22]。

4.2 PBMC體外檢測熱原機(jī)理

利用從健康人體全血分離得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）模擬人體，將其與熱原標(biāo)準(zhǔn)品（如細(xì)菌內(nèi)毒素）、受試藥品分別孵育，通過比較其所致內(nèi)源性熱原（主要為細(xì)胞因子，如IL-6、IL-1、TNF-α）分泌量的多少，反映藥品的致熱活性。

4.3 PBMC分離、培養(yǎng)

健康志愿者外周血與等量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 混合稀釋后，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液的上方，密度梯度離心20min（2500 r﹒min-1）。小心收集位于分離液和血漿之間的單個(gè)核細(xì)胞層，并用PBS清洗2遍[23]，系統(tǒng)采用96孔組織培養(yǎng)板進(jìn)行孵育，每孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基100 uL、樣品或空白對照品50 uL，37 ℃，5% CO2，95%濕度條件下孵育16～24 h，吸取上清液用ELISA方法檢測細(xì)胞因子的含量[22]。

4.4 細(xì)胞因子（IL-6）檢測

單核細(xì)胞激活檢查法以人全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)或單核細(xì)胞系作為檢測用細(xì)胞。一般有三種方法，包括定量測定法、半定量測定法和參考批次比較測定法。定量測定法通過標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出熱原的值；半定量測定法通過與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液比較得出熱原的濃度；參考批次比較測定法是供試品和經(jīng)過驗(yàn)證的該制品的參考批次相比較來檢測的一種方法。

目前選用的檢測指標(biāo)還沒有完全趨于統(tǒng)一[24]。查閱文獻(xiàn)[25～26]表明IL-6可作為一個(gè)很好的檢測指標(biāo)。并且美國食品藥品監(jiān)督管理局以同意將PBMC/IL-6檢測法作為產(chǎn)品終熱原檢測的一個(gè)方法[25]。同時(shí)單核、巨噬細(xì)胞是重要的免疫感應(yīng)和效應(yīng)細(xì)胞, 單核巨噬細(xì)胞受抗原、有絲分裂原或活化因子作用后, 能轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨膯魏?、巨噬?xì)胞。單核、巨噬細(xì)胞的免疫功能一方面直接吞噬破壞靶細(xì)胞和靶抗原, 另一方面又能分泌多種細(xì)胞因子, 并通過細(xì)胞因子繼續(xù)產(chǎn)生免疫效應(yīng)[27～28]PBMC包含了人血中能分泌免疫細(xì)胞因子的各主要細(xì)胞。因此可以用ELISA法檢測使用PBMC細(xì)胞培養(yǎng)的樣品或空白對照品。

5 結(jié)論

熱原檢測是嚴(yán)格控制各類非腸道用醫(yī)藥制品的質(zhì)量，保障人民用藥安全，促進(jìn)醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的重要手段。從最開始的家兔檢測法到研究最為深入的細(xì)菌內(nèi)毒素法，本文從分析目前傳統(tǒng)主要用于熱原檢測的方法的優(yōu)缺點(diǎn)，到對體外熱原檢測新方法的提出再到本文主要綜述的PBMC法。包括了PBMC的分離、培養(yǎng)、細(xì)胞因子的檢測。

PBMC法可以很好檢測熱原，但依然存在某些問題急需解決：①試驗(yàn)中的試劑，血清等去除熱原的問題；②實(shí)驗(yàn)室安全問題，使用的細(xì)胞株是否易受感染；③檢測細(xì)胞因子的試劑盒及使用的標(biāo)準(zhǔn)品因生產(chǎn)廠家不同和同一廠家不同批號存在差異；④血液來源的安全性，個(gè)體對熱原敏感性的差異。PBMC法作為體外熱原檢測方法之一，有很好重復(fù)性、再現(xiàn)性，檢測普廣，有很好的應(yīng)用前景，同時(shí)滿足3R[29]即減少(reduction)、替代(replace ) 和優(yōu)化(refinement )實(shí)驗(yàn)動物的使用精神的體現(xiàn)。

[1]夏振明.略談藥品注射劑之熱原[J].中華核醫(yī)學(xué)雜志,1991，(11):273.

[2]賀爭鳴,邢瑞昌.熱原質(zhì)檢測方法(一)[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志,2001,9,(11)3:156;2001.12,(11)4:243.

[3]Steinet z BG, Randolph C, Werner R, et al. Pyrogenicity of etiocholanolone and interleukinlin new and world monkeys[J].Proc Soc Exp Biol Med,1998,217:435.

[4]邵小燕,張漢荊.重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)產(chǎn)品中熱原檢測方法探討[A].醫(yī)藥質(zhì)量管理QC成果論文集[C].上海市質(zhì)量管理協(xié)會醫(yī)藥委員會編,1999:32-33.

[5]Stitt JT. Evidence for the involvenment of the organum vasculosum laminate terminals in the febrile response of rabbits and rats[J].J Physiol(Lond),1985,368:501.

[6]蔣建新(主編).細(xì)菌內(nèi)毒素基礎(chǔ)與臨床[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2004.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄:99.

[8]Schindler S, Bristow A, Cartmell T, et al. Comparison of the reactivity of human and rabbit blood towards pyrogenic stimuli[J]. Altex,2003,20(2):59.

[9]Charles River Laboratories: In Vitro Pryogen Test(LPT)Endosafe Time,http://www.criver.com./products/invitro/endotoxin/pdf/endosafe_times_june02.pdf,2002-06.

[10]Bang FB.A bacterial disease of limulus polyphemus[J]. Bull Johns Hopkins Hosp,1956,98(5):325.

[11]Liven J, Bang FB. Clottable protein in limulus:its localization and kinetics of its coagulation by entodoxin[J].Trombos Diathes Haemorrh,1968,31,19(1):186.

[12]胡可可,夏振民.藥品注射劑的熱原檢查[J].中國海洋藥物雜志,1991,4:26.

[13]Duff GW,Atkins E.The detection of entodoxin by in vitro production of endogenous pyrogen:comparion with limulus amebocyte[J].J Immunol Methods,1982,52:323.

[14]Dinarello CA,O Conor JV,Lopreste G, et al.Human leukocytic pyrogen test for detection of pyrogenic material in growth hormone produced by recombinant Escherichia coli[J].J Clin Microbiol,1984,20:323.

[15]Nakagawa Y,Maeda H,Murai T.Evaluation of the in vitro pyrogen test system based on proinflammatory cytokine release from human monocytes:Comparison with a human whole blood culture test system and rabbit pyrogen test[J].Clin Diagn Lab Immunol,2002,9:588.

[16]Poole S,Mistry Y,Ball C,et al.A rapia‘one-plate’in vitro test for pyrogens[J].J Immunol Methods,2003,274:209.

[17]Peterbauer A,Eperon S,Jungi TW,et al.Interferonprimed monocytoid cell lines:Optimizing their use for in viteo detection of bacterial pyrogens[J].J Immunol Methods,2000,233:67.

[18]Eperon S,Jungi TW.The use of human monocytoid lines as indicators of endotoxin[J].J Immunol Methods,1996,194:121.

[19]歐洲藥典委員會.《歐洲藥典》(EUROPEAN PHAMR COPOEIA 7.0)[M].歐洲:歐洲藥品質(zhì)量管理局,2010.

[20]Lise Moesby,Susanne Jensen,Erik W Hansen,et al.A comparativestudy of menu mac6 cells isolated monouclear cells and limulusa-moebocyte lysate assay in pyrogen testing[J].Int J Pharm,1999,191:141.

[21]Suffredini F,Donald Hochstein H,Gilbert McMahon F.Doserelated inflammato effects of intravenous endotoxin in human:evaluation of a new clinical lot of Escherichia colio:113 endotoxin[J].J Infect Dis,1999,179:1278.

[22]Sebastian Hoffmann,Anja Peterbauer,Strfanie Schindler,et al.International validation of novel pyrogen tests based on human monocytoid cells[J].Journal of Immunological Methods,2005,298:161.

[23]周冬梅,謝曉芳,莊燕,等.不同表面電荷的陽離子脂質(zhì)體對人外周血單核細(xì)胞活化和細(xì)胞活性的影響[J].生物物理學(xué)報(bào),2010,8(26):726.

[24]Dinarello CA.Cytokines as endogenous pyrogens[J].J Infect Dis,1999,179(suppl 2):294.

[25]譚德講,任君,杜穎,等.熱原和熱原檢測方法的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)分析雜志,2004,24(6):653.

[26]黃清泉,劉文英,丁黎,等.體外人全血熱原檢測方法研究[J].中國藥學(xué)雜志,2004,5,39(5):372.

[27]Yu L,Ma R,Yu T,et al.Antitumor and antitumor-promoting actions of macrophages and their relationship with estrogen[J].Oncology,1996,53:322.

[28]Davis JM,KohutmL,Jackson DA,et al.Exercise effects on lungtumor metastases and in vitro alveolar macrophage antitumor cytotoxicity[J].Am J Physiol,1998,274:1454.

[29]Hartung T,Crameri R,Wendel A.Development of a pyrogen test basted on rabbit on blood[J].Altern Anim Exp,1998,15(5):17.