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        新型脫碳木脂素類化合物合成方法與腫瘤抑制活性研究*

        2012-08-14 12:01:34向建南劉開建李君姊梁志武
        關(guān)鍵詞:木脂素脫碳培養(yǎng)箱

        向建南,劉開建,李君姊,梁志武

        (湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410082)

        木脂素(Lignan)是一類基本骨架結(jié)構(gòu)為苯丙素單元的天然化合物,存在于植物的根、莖、葉和果實(shí)中.它具有抗腫瘤[1-2]、抗病毒[3-4]、抗氧化和肝臟保護(hù)[5]、抗菌消炎[6-8]、血小板活化因子(PAF)拮抗調(diào)節(jié)[9-11]生物活性.研究發(fā)現(xiàn),帶有此類結(jié)構(gòu)單元的化合物可能具有與木脂素相似的生物活性,因此對(duì)此類化合物的合成方法及生物活性分析也成為化學(xué)家的研究熱點(diǎn)之一.

        本實(shí)驗(yàn)以芳基烯烴衍生物為原料,利用Mn(II)/Co(II)/PhP(O)HOR/O2新催化體系合成了7個(gè)脫碳木脂素類化合物(2a~2g),并利用人乳腺癌細(xì)胞 (MCF-7),人 肝 癌 細(xì) 胞 (Bel-7402),人 肺 癌(A549)和人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)4種癌細(xì)胞采用MTT法對(duì)所合成化合物的腫瘤細(xì)胞體外抑制活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)[12].化合物合成路線見Scheme 1.

        方案1 化合物2a~2g合成路線

        Scheme1. Synthetic routes of compound 2a~2g

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 主要材料

        所有底物均為市售;苯基二氯化磷購(gòu)自天津Alfa Aesar公司;Mn(OAc)2,Co(OAc)2購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;本實(shí)驗(yàn)合成的新型脫碳木脂素類化合物(2a~2g);細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640,無鈣鎂PBS粉劑、胰蛋白酶、抗生素(青霉素和鏈霉素)均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;標(biāo)準(zhǔn)新生小牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司.

        人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7,人肝癌細(xì)胞 Bel-7402,人肺癌細(xì)胞A549,人宮頸癌細(xì)胞Hela均購(gòu)自湖南湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù).

        1.1.2 主要儀器

        Beijing Taike XT-4microscopy熔點(diǎn)測(cè)定儀,溫度計(jì)未做校正;LCQ Advantage ion trap mass spectrometer低分辨質(zhì)譜儀,測(cè)定模式為ION source:ACPI(大氣壓化學(xué)電離,正離子模式);Varian INOVA-400Spectometer核磁共振儀,使用TMS為內(nèi)標(biāo),CDCl3為溶劑;6孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司);XSP-15C型倒置顯微鏡(上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司);HF151UV型CO2培養(yǎng)箱、HFsafe-1500型超凈工作臺(tái)(上海力申科學(xué)儀器有限公司);-80℃超低溫冰箱(合肥中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司);正置熒光顯微鏡(Nikon80i,Japan);超純水制備儀(美國(guó) Milli-Q 公司);Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);TMQ.R型高壓滅菌鍋(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司);5702R型低溫臺(tái)式離心機(jī)、5418低溫臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司).

        1.2 化合物2a~2g合成

        PhP(O)HOBu參照文獻(xiàn)方法[13]制得,化合物2a~2g的合成方法為:在干燥的50mL三頸燒瓶中加入底物 1(1mmol)、醋 酸錳 (0.009g,0.05 mmol)、醋酸鈷(0.009g,0.05mmol),再加入25 mL乙酸作溶劑,然后加入現(xiàn)制丁基苯基亞膦酸酯(0.59g,3.0mmol),在持續(xù)通入氧氣的條件下90℃反應(yīng)24h.反應(yīng)完畢,待冷卻后加入飽和碳酸鈉溶液中和乙酸,不再有氣泡產(chǎn)生后加入乙醚萃取3次,萃取液用飽和食鹽水洗3次,再用無水硫酸鎂干燥,濃縮后經(jīng)柱色譜(200~300目)分離,得到二聚化合物2.

        1.3 MTT法檢測(cè)化合物的抑制率實(shí)驗(yàn)過程(以 M CF-7為例)

        1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇

        從液氮生物容器中取出MCF-7細(xì)胞株離心管,快速將其放入37℃恒溫振蕩水槽中輕微搖晃,并使MCF-7在1min之內(nèi)全部融解,然后用酒精擦拭管口消毒,打開管蓋,將MCF-7細(xì)胞懸液放入15mL離心管中,再添加10倍體積的每mL含各100單位的青霉素和鏈霉素的RPIM1640細(xì)胞培養(yǎng)液,放入離心機(jī)中在1 000r/min的速度下離心5min,取出上清液,用5mL細(xì)胞培養(yǎng)液吹打?qū)⒓?xì)胞團(tuán)分散使其形成懸浮液,然后吸取裝入培養(yǎng)瓶,置入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

        1.3.2 接種

        將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)瓶取出并倒去培養(yǎng)液,再用5mL PBS緩沖液沖洗細(xì)胞,然后再加入2mL 0.25%的胰蛋白酶放入培養(yǎng)箱中消化3 min,接著取出培養(yǎng)瓶加入11mL培養(yǎng)液反復(fù)吹打形成懸浮液,在一塊96孔板中每孔用移液槍吸取濃度為1x105個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液100μL,再將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h.

        1.3.3 配樣

        將所合成的新型脫碳木脂素類化合物分別用DMSO溶解后配制成10g/mL的溶液,再分別用培養(yǎng)液配制成5種濃度的樣品溶液100μg/mL,50μ g/mL,25μg/mL,10μg/mL,5μg/mL.

        1.3.4 上樣

        取出培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)板并在培養(yǎng)板每孔上樣100μL.5種濃度的樣品溶液每個(gè)濃度取4個(gè)平行孔加入。在此過程中設(shè)3組對(duì)照實(shí)驗(yàn)包括空白組(僅培養(yǎng)液)、陰性組(細(xì)胞懸液、培養(yǎng)液)、受藥組(不同濃度的樣品溶液、細(xì)胞懸液、培養(yǎng)液),完成上樣后將孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h.

        1.3.5 收板

        將繼續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)板取出并吸取每孔中的溶液,然后用PBS緩沖液100μL反復(fù)清洗,之后每孔加入體積比為1∶1的MTT與PBS混合液40μL,再置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5h,完成后取出培養(yǎng)板并吸出MTT液,再在每孔中加入150μL DMSO并輕微振蕩以使生成的甲瓚完全溶解.

        1.3.6 測(cè)值

        測(cè)試方法采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其光吸收值并利用所得結(jié)果計(jì)算IC50值。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x(-)±S.D),采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件(美國(guó)SPPS公司)進(jìn)行單向方差分析或t檢驗(yàn).其計(jì)算公式如下:

        2 結(jié)果與討論

        化合物的半抑制濃度IC50值是衡量一個(gè)化合物是否具有腫瘤抑制活性的一個(gè)極為重要的數(shù)據(jù),其值的大小直接反映了化合物腫瘤抑制活性的強(qiáng)弱.作者將每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行了3次,并根據(jù)光吸收值計(jì)算了本實(shí)驗(yàn)室合成的新型脫碳木脂素類化合物2a~2g對(duì) MCF-7,Bel-7402,A549和 Hela4種腫瘤細(xì)胞作用48h的半數(shù)抑制濃度IC50值,見表1.

        從表1可以看出,采用MTT法測(cè)試的脫碳類木脂素化合物2a~2g都對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了一定的抑制作用.從表中數(shù)據(jù)來看,所測(cè)腫瘤細(xì)胞中化合物2b對(duì)于各腫瘤細(xì)胞都有較好的抑制作用,并且其對(duì)于腫瘤細(xì)胞Bel-7402的半抑制濃度IC50值達(dá)到了18.9μg/mL的極低數(shù)值,遠(yuǎn)低于做為對(duì)照組的紫杉醇在相同條件下的半抑制濃度IC50值28.0μg/mL,而紫杉醇現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物中,因此,化合物2b應(yīng)具有較好的開發(fā)前景.同時(shí)也可以看到對(duì)于癌細(xì)胞Heal,此類化合物作用效果相對(duì)較差,抑制效果最好的化合物2aIC50值也達(dá)到了48.8μg/ml.在體外抗腫瘤活性研究中,化合物作用腫瘤細(xì)胞的時(shí)間依賴性也是一個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn).作者以Bel-7402為例,分別以24h和48h對(duì)此類脫碳木脂素化合物作用腫瘤細(xì)胞的時(shí)間依賴性進(jìn)行了考察,如圖1所示.

        表1 化合物2a~2g抗MCF-7,Bel-7402,A549和Hela的抑制活性(ˉx±S.D.,n=3,48h)Tab.1 Cytotoxic activities of compounds 2a~2g against MCF-7,Bel-7402,A549and Hela(ˉx±S.D.,n=3,48h)

        圖1 化合物2a~2g作用Bel-7402 24h和48h的抑制活性Fig.1 Cytotoxic activities of compounds 2a~2gagainst Bel-7402with 24hand 48h

        從圖中可以看出,化合物對(duì)于時(shí)間都有一定的依賴性,特別是對(duì)于化合物2a,其24h半抑制濃度幾乎為48h的兩倍,而其它化合物時(shí)間依賴性相比2a要小.

        3 結(jié) 論

        利用Mn(II)/Co(II)/PhP(O)HOR/O2新催化體系合成了一系列新型脫碳木脂素類化合物(2a~2g),并利用MTT法測(cè)得了所合成化合物的半抑制濃度IC50值及其與時(shí)間的關(guān)系.結(jié)果表明,此類芳基烯烴二聚化合物(2a~2g)對(duì)所測(cè)4種癌細(xì)胞均具有一定的抑制作用,并且化合物對(duì)癌細(xì)胞的作用效果有一定的時(shí)間依賴性.另外,此類化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402的抑制效果尤為明顯,其中化合物2b的效果最為顯著僅為18.9μg/mL,比已被廣泛應(yīng)用于各種抗腫瘤藥物中的陽(yáng)性對(duì)照組紫杉醇效果更優(yōu),因此,化合物2b應(yīng)具有較為廣闊的研究應(yīng)用價(jià)值.

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