桑傳蘭，王 蕭＊，多海剛，陳 嘉，梁 朗，董浩然

（1.廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，廣東廣州510405；2.廣東藍島生物技術有限公司，廣東廣州510555）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproduction and respiratory syndrome，PRRS）是20世紀80年代末期90年代初期出現(xiàn)的一種病毒性傳染病，PRRS主要引起母豬和后備母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道癥狀。近年來關于PRRS的病原學、流行病學、臨床癥狀和血清學診斷等方面已有大量報道，但至今對本病的發(fā)病機理還不清楚。本試驗旨在用天津地區(qū)分離株PRRSV-SJ株滴鼻感染10日齡～15日齡PRRSV陰性的健康仔豬，觀察PRRSV在仔豬體內靶器官的分布規(guī)律，明確其病毒的致病特點和發(fā)展規(guī)律，為進一步研究PRRSV的致病機理奠定基礎，同時也為制定科學的防控措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 10日齡～15日齡健康的仔豬20頭，經美國IDEXX公司PRRSV ELISA試劑盒檢測為陰性，購自天津種豬場。

1.1.2 試驗用病毒 PRRSV-SJ株由天津畜牧獸醫(yī)研究所病毒室分離并保存，TCID50為10-5.58／0.1 mL。

1.1.3 主要試劑 PRRSV MAb 15A1來源于美國，由農業(yè)部獸醫(yī)診斷中心提供；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H＋L）為北京中山生物技術有限公司進口分裝產品；50mL／L的馬血清（PBS稀釋）為北京中山生物技術有限公司產品；3.3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）為北京市聯(lián)合化工廠產品；蘇木素（hematoxylin，進口分裝）為北京化學試劑公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人工感染方法 15頭仔豬滴鼻接種PRRSV-SJ毒株，3mL／頭，每日測量體溫，觀察臨床癥狀，并于感染后1、7、14、21、28d各處死3頭。對照組5頭滴鼻正常細胞培養(yǎng)物，3mL／頭，與感染組相對應的時間，各處死1頭。

1.2.2 取材 剖檢取出的氣管（中部）、肺、脾臟、扁桃體、淋巴結（肺門淋巴結、頸下淋巴結、腸系膜淋巴結、腹股溝淋巴結）腎臟等新鮮組織病料放入100 mL／L的中性緩沖福爾馬林液中固定。

1.2.3 免疫組織化學法 常規(guī)制作石蠟切片［13］，切片常規(guī)脫蠟、洗滌、封閉后，滴加稀釋比例適當的一抗，在濕盒37℃40min后，4℃冰箱內過夜，滴加稀釋比例適當的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠的IgG（二抗）。在濕盒中37℃1h，洗滌后DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水、封片。

2 結果

2.1 氣管

PRRSV感染1d后，病毒抗原主要分布于氣管上皮和固有膜，并且從1d～28d的感染期間，氣管中的抗原陽性細胞分布較少，陽性反應也不強烈（圖1），陰性對照見圖2。

2.2 肺臟

陽性細胞分布在肺泡間隔、肺泡壁上、支氣管及細支氣管上皮。但在感染21d～28d后，陽性細胞少，陽性反應也不強（圖3），陰性對照見圖4。

2.3 肺門淋巴結

感染1d～28d，陽性細胞主要分布在淋巴結皮質部及生發(fā)中心周邊，陽性細胞量多，陽性反應也強烈（圖5），陰性對照見圖6。

2.4 扁桃體

感染1d～28d，陽性細胞主要分布在扁桃體的隱窩及周遍（圖7），陰性對照見圖8。

2.5 脾臟

感染7d后，抗原陽性細胞少，陽性反應弱。感染14d～28d期間，在髓質、皮質區(qū)都有大量的陽性細胞分布，陽性反應也很強（圖9），陰性對照見圖10。

圖1 PRRSV感染氣管Fig.1 Positive expression in nasal mucosa tissue

圖2 氣管黏膜陰性對照Fig.2 Negative expression in control nasal mucosa tissue

圖3 PRRSV感染的肺組織Fig.3 Positive expression in lung tissue

圖4 肺組織陰性照Fig.4 Negative expression in control lung tissue

圖5 PRRSV感染的肺門淋巴結Fig.5 Positive expression in Bronchpulmonary lymph tissue

圖6 肺門淋巴結陰性對照Fig.6 Negative expression in control bronchpulmonary lymph tissue

圖7 PRRSV感染的扁桃體Fig.7 Positive expression in tonsil tissue

圖8 扁桃體陰性對照Fig.8 Negative expression in tonsil tissu

圖9 PRRSV感染的脾臟組織Fig.9 Positive expression in spleen tissue

圖10 脾臟組織陰性對照Fig.10 Negative expression in spleen tissue

3 討論

用間接免疫組織化學法觀察了感染后1d～28 d的PRRSV抗原在氣管、鼻黏膜、肺、脾、腎、淋巴結、扁挑體的分布動態(tài)。結果顯示，病毒在感染1d后，PRRSV可以在肺、氣管、淋巴結、扁挑體等組織中檢出。說明經鼻內接種PRRSV-SJ株可在相應的組織中復制和增殖，這一結果與劉萬鈴等［1-2，5］試驗結果相一致。

一般認為肺臟是PRRSV作用的原發(fā)性靶器官，是該病毒的主要侵害器官［4-5］。本試驗研究發(fā)現(xiàn)肺組織中的病毒陽性細胞分布數量和陽性反應程度都不如文獻中描述的分布廣，數量多及陽性反應強。本試驗的結果與任慧英等［10］用原位分子雜交技術檢測仔豬肺組織中的病毒核酸陽性結果一致。Haynes J S等［12］報道兩種不同致病性的毒株感染動物，強致病性的毒株與低致病性的毒株在同一時間內相比，強致病性的毒株能在更多的組織和更長的時間檢出PRRSV陽性細胞，并且在肺中的陽性細胞數量及反應強度也高于低致病性毒株。本試驗所用的PRRSV S J毒株是否屬于低致病性毒株有待于進一步研究。

Rossw K D 等［3-6，11］認 為 PRRSV 通 過 鼻 黏 膜或呼吸道進入肺臟，引起肺內巨噬細胞增生并復制病毒，病毒很快進入肺組織血管，并在內皮細胞中進一步復制經血液循環(huán)引起全身病毒血癥。本試驗結果為，脾臟、腎臟在感染7d～28d后都可檢出PRRSV抗原陽性細胞，但在14d～28d的抗原陽性細胞數量和陽性反應強度最強，從本試驗的結果分析，PRRSV是以病毒血癥的方式擴散到小血管，毛細血管，并在這里增殖導致相應的病變，脾臟、腎臟血管漏出的病毒又為大量的巨噬細胞吞噬和復制，因此在感染后期出現(xiàn)了大量的抗原陽性細胞，在這個試驗中，作者認為脾是感染后期診斷和分離病毒的最佳病料。

Yoon I J等［5-6，9］研 究 發(fā) 現(xiàn)，PRRSV 感 染 12h后在鼻黏膜上皮細胞檢出PRRSV陽性細胞，14d～21d后又再次檢出，同時檢測到鼻黏膜PRRSV病毒滴度高于血清病毒滴度，說明PRRSV是通過鼻黏膜排毒引起本病的感染的主要原因，因此鼻黏膜可作為本病的早期診斷。本試驗從1d～28d都能在鼻黏膜中檢出PRRSV病毒抗原，但鼻黏膜的陽性細胞數量及陽性反應強度都不如肺門淋巴結，扁桃體強烈，因此扁桃體和肺門淋巴結是早期診斷本病的最佳病料。

［1］ 劉萬鈴，余樹民，徐志文，等.PRRSV SC-1株在人工感染仔豬體內的分布［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（7）：36-38.

［2］ 陳申秒，馬景霞，王金生，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒人工感染試驗［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（1）：110-114.

［3］ 李燕華，郭 鑫，楊漢春，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬園環(huán)病毒2型共感染豬組織中豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的分布［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45（1）：9-12.

［4］ 楊 鴻，錢君娣，何啟蓋，等.病豬肺組織中PRRSV抗原免疫組織化學Envision法的原位檢測［J］.中國獸醫(yī)科學，2009，30（3）：237-240.

［5］ Rossow K D，Benfield D A，Goyal S M，et al.Chronological immunohistochemical detection and location of porcine reproduction and respiratory syndrome virus infection in gnotobiotic pigs［J］.Vet Pathol，1996，33：551-556.

［6］ Rossow K D，Bautista E M，Goyal S M，et al.Experimental reproductive infection in one-four-ten-week-old-pigs.［J］.Vet Diagn Invest，1994，6：3-12.

［7］ HaLbur P G，Paul P S，F(xiàn)rey M，et al.Comparative pathogenicity of nine US porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）isolation in five-week-old cesarean derived，colostrums-deprived pig model［J］.Vet Diagn Invest，1996，8：11-20.

［8］ Halbur P G，Paul P S，F(xiàn)rey M，et al.Comparison of the anti-gen distribution of two U.S.porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolation with that of lelystad virus［J］.Vet Pathol，l996，33：159-170.

［9］ Yoon I J，Joo H S，Christianson W T，et al.Field isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRS）vary in their susceptibility to antibody dependent enhancement（ADE）of infection［J］.Vet Microbiol，1997，55：277-287.

［10］ 任慧英，李文志，楊漢春，等.應用原位雜交技術研究母源抗體對PRRS病毒在體內的增值的影響［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2002，22（5）：372-374.

［11］ 尹訓南，郭寶清，司昌德，等.豬生殖-呼吸綜合征病毒在仔豬體內定位研究［J］.中國畜禽傳染病，1997（5）：47-49.

［12］ Haynes J S，Halbur P G，Sirnarumit T，et al.Temporal and morphologic characterization of the distribution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）by in situ hybridization in pigs infected with isolated of PRRSV that differ in virulence［J］.Vet Pathol，l997，34（1）：39-43.

［13］ 何書海，陳宏智，焦鳳超.動物病理組織切片制作方法的改良［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（11）：130-132.