孫敏華，董嘉文，呂殿紅，周秀蓉，李林林，胡奇林

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 廣東省公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東廣州510640）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的急性高度接觸性傳染病。早在1971年，Higgins D A［1］在香港發(fā)現(xiàn)9起鴨新城疫病毒感染的急性病例，并分離出高致病性的NDV。而自2000年后，我國分離鑒定的絕大多數(shù)鴨新城疫病毒對鴨的致死率在50%以上，對雞的致死率可高達100%［2-4］。其中，部分毒株與水禽新城疫病毒關(guān)系密切［5］。由于NDV宿主范圍廣泛，且目前高致病性毒株所占比例大，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的威脅。

目前，新城疫的確診主要依靠病毒的分離鑒定，該法準確、特異，但相對費時費力。ELISA方法能進行批量檢測、速度快，適合于基層獸醫(yī)和動物檢疫部門使用。1995年，吳紅專等研制出新城疫單抗夾心ELISA試劑盒，臨床樣本的檢測結(jié)果表明其陽性符合率達100%［6］。也建立了針對甲型H1N1流感病毒及鹿流行性出血病病毒的雙抗體夾心ELISA方法［7-8］。鑒于此，本研究制備了抗鴨新城疫病毒單克隆抗體，建立了單抗夾心ELISA方法，為快速診斷鴨新城疫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞系 1.5kg清潔級新西蘭兔和6周～8周齡Balb／c雌性小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，骨髓瘤細胞SP2／0由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)郭霄峰教授惠贈。

1.1.2 試劑 HAT選擇培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；HT培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品；PEG 1450為Sigma公司產(chǎn)品；蛋白分子量標準Fermentas公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗鼠二抗為Proteintech公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗兔二抗和弗氏佐劑為鼎國生物有限公司產(chǎn)品；禽流感H5、H9標準陽性抗原為哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品；ELISA反應(yīng)板為Corning公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 鴨新城疫病毒由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病研究室鑒定、保存。經(jīng)尿囊腔接種于12日齡鴨胚，收集24h后死亡的鴨胚尿囊液，經(jīng)差速和蔗糖密度梯度離心純化，測定蛋白含量，保存于-70℃，用作免疫抗原和包被抗原。

1.2.2 ELISA篩選方法的建立 參照文獻［9］選擇6周齡雌性Balb／c小鼠進行免疫，采集血清。將Balb／c小鼠陽性血清和陰性血清均作倍比稀釋，同時設(shè)立SP2／0細胞培養(yǎng)上清及空白對照，選擇OD490nm值在1.0左右，P／N比值最大的抗原稀釋濃度為最適工作濃度。

1.2.3 單克隆抗體及腹水的制備、篩選和鑒定 按照常規(guī)方法融合［9］，用ELISA方法篩選陽性克隆，進行亞克隆及腹水制備。制備鴨胚成纖維細胞，參考文獻［9］進行單抗中和活性的測定。取細胞培養(yǎng)上清單克隆抗體，按照 Mouse MAb Isotyping Kit（Hycult Biotech）說明書進行亞類鑒定。測定單抗亞類后，用間接ELISA方法測定腹水效價。

1.2.4 單克隆抗體的特異性 將傳染性支氣管炎病毒 （IBV）、禽 呼 腸病毒 （ARV）、鵝 細 小病毒（GPV）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨瘟病毒（DPV）、NDV LaSota株、F48E9株尿囊液以及禽流感H5、H9標準陽性抗原按1∶10稀釋后包被ELISA反應(yīng)板，應(yīng)用ELISA方法進行測定。

1.2.5 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立及其特異性、敏感性和重復(fù)性試驗 用PEG沉淀法［10］對2C1腹水進行純化；用辛酸-硫酸銨沉淀法［11］對兔抗鴨新城疫病毒血清進行純化，測定蛋白含量，用SDS-PAGE鑒定純度。分別以純化的單抗和多抗為包被抗體，進行雙抗體夾心ELISA，以確定最佳包被抗體。以方陣法確定抗體、抗原最佳工作濃度、作用時間等。特異性試驗是以DPMV尿囊液作為陽性對照，正常雞胚、鴨胚尿囊液為陰性對照，對IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 的尿囊液及 H5、H9標準陽性抗原進行ELISA檢測。敏感性試驗是將DPMV尿囊液作1∶5～1∶5 120稀釋，分別測定其血凝活性及ELISA效價，以確定該方法的敏感性。重復(fù)性試驗是將DPMV陰、陽性尿囊液分別按1∶10、1∶20稀釋，各做3個重復(fù)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)計算批內(nèi)變異系數(shù)；在不同時間重復(fù)3次該試驗，統(tǒng)計數(shù)據(jù)計算批間變異系數(shù)。

1.2.6 雙抗體夾心ELISA方法檢測臨床樣品時陰陽性判定標準的確定 以雙抗體夾心ELISA方法檢測30份NDV非免疫雞的泄殖腔拭子樣品，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則，樣本的OD490nm值＞陰性樣本OD均值（ˉX）＋3×SD時，可以在99.9%的水平上判定為陽性。

1.2.7 人工感染樣品的檢測 取DPMV尿囊液1∶10稀釋后人工滴鼻感染3只6周齡SPF雞，每只0.2mL。分別于感染后1d～7d，采集對照組和感染雞的泄殖腔拭子于2mL PBS中，擠壓拭子后，5 000r／min離心5min，取0.1mL上清用ELISA方法檢測，同時平行取0.3mL上清用雙抗處理后，接種SPF雞胚制備的成纖維細胞單層進行病毒分離，每份樣品接3孔細胞，每孔0.1mL。病毒鑒定采用血凝和血凝抑制試驗。

2 結(jié)果

2.1 抗原的制備

感染鴨胚尿囊液經(jīng)高速離心沉淀，蔗糖密度梯度純化，取出40%～60%之間的白色病毒層，脫糖后，將沉淀溶于3mL PBS中，紫外分光光度計測得病毒的蛋白含量為6.52mg／mL。

2.2 單克隆抗體的篩選及其特性測定

當(dāng)包被的病毒量為0.8μg／孔，陽性鼠血清1∶800稀釋，羊抗鼠二抗1∶10 000倍稀釋時，P／N比值最大，且陽性值最接近1.0。因此，選擇該條件下的抗原包被量和二抗作用濃度來篩選單克隆抗體。細胞融合后，經(jīng)ELISA篩選，選取P／N＞3.0的細胞孔，用有限稀釋法克隆3次后，獲得一株穩(wěn)定的雜交瘤細胞株，命名為2C1。特異性試驗表明，2C1不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV尿囊液以及禽流感H5、H9標準陽性抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，但與新城疫病毒La Sota株、F48E9株尿囊液發(fā)生反應(yīng)；中和試驗結(jié)果表明，該株單抗沒有中和活性；抗體亞類鑒定表明，該單克隆抗體重鏈為IgM，輕鏈為κ鏈（圖1）。雜交瘤細胞株2C1所制備的腹水ELISA效價大于1∶64 000。

圖1 單克隆抗體2C1亞類鑒定結(jié)果Fig.1 Subtype identification of monoclonal antibody 2C1

2.3 雙抗體夾心ELISA方法的初步建立

2C1腹水用120g／L的PEG6000溶液沉淀兩次。兔抗NDV血清經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化、透析、離心后，與純化前的腹水和多克隆抗體進行SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn)，純化后的抗體在凝膠中均呈現(xiàn)出重鏈和輕鏈兩條特異性的條帶，且大小與預(yù)期相符（圖2）。ELISA試驗表明，以純化后的2C1腹水作為包被抗體，兔抗DPMV多克隆抗體為第二抗體，其P／N值高，且陰陽性區(qū)別明顯。方陣試驗結(jié)果表明，當(dāng)純化后的單抗包被量為4μg／孔，鴨副黏病毒尿囊液1∶10稀釋，兔抗鴨副黏病毒多克隆抗體濃度為0.1μg／孔，HRP標記的羊抗兔二抗1∶10 000倍稀釋，每種組分作用1h時，P／N值最大，條件最優(yōu)。

圖2 單抗2C1及抗NDV兔血清純化前后SDS-PAGE電泳比較結(jié)果Fig.2 The comparison of SDS-PAGE results of the unpurified and precipitated monoclonal antibody 2C1and polyclonal antibody against duck NDV

2.4 雙抗體夾心ELISA方法特異性、敏感性和重復(fù)性的確定

在最佳工作條件下，IBV、ARV、GPV、DHV、DPV的尿囊液以及禽流感H5、H9標準陽性抗原的OD490nm值最高為0.122，與陰性對照的比值小于2，特異性良好（表1）。倍比稀釋后的尿囊液HA效價為1∶10，ELISA效價（按P／N＞3.0計算）為1∶640，因此判定ELISA方法敏感性至少比HA高64倍（表2）。純化的鴨副黏病毒稀釋后，ELISA至少可以檢測到0.2μg的病毒（表3）。重復(fù)性試驗表明，兩個稀釋度抗原的批間重復(fù)變異系數(shù)為5.22%～9.15%，批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)為2.03%～5.34%。

2.5 雙抗體夾心ELISA方法檢測臨床樣品時陰陽性判定標準的確定

30份未免疫新城疫疫苗的雞泄殖腔拭子ELISA檢測平均OD值為0.130，標準差為0.038，計算可得，當(dāng)樣品的OD490nm值大于0.244時，可判定為陽性。

2.6 人工感染樣品的檢測結(jié)果

根據(jù)ELISA陰陽性判定標準判定，1號雞第4天和第5天拭子檢測結(jié)果為陽性；2號雞無陽性結(jié)果；3號雞攻毒后第3、第4、第5天檢測結(jié)果陽性。這些ELISA陽性檢測結(jié)果中，1號和2號的檢測結(jié)果與病毒分離相符合，而第3號雞攻毒后的第3天和第6天檢測結(jié)果與病毒分離不符。綜合計算，ELISA檢測結(jié)果與病毒分離的總符合率為91.7%（表4）。

表1 雙抗體夾心ELISA特異性檢測結(jié)果Table 1 The specificity of the sandwich ELISA

表2 HA和雙抗體夾心ELISA檢測鴨新城疫病毒結(jié)果比較Table 2 The results of HA test and the sandwich ELISA for detecting the duck NDV

表3 雙抗體夾心ELISA方法敏感性試驗Table 3 The sensitivity of the sandwich ELISA

表4 人工感染樣品ELISA檢測結(jié)果Table 4 The detective results of experimentally infected chickens by sandwich ELISA

3 討論

本研究采用蔗糖密度梯度離心法純化了鴨新城疫病毒，利用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，獲得了一株抗鴨新城疫病毒單克隆抗體2C1的雜交瘤細胞株。單抗篩選采用了全病毒包被的間接ELISA方法，擴大了篩選范圍。2C1經(jīng)中和試驗后，發(fā)現(xiàn)其不具有中和活性，因此在后續(xù)制備具有中和活性的單抗時用HI試驗篩選可能會獲得理想的結(jié)果。經(jīng)ELISA檢測，2C1腹水的ELISA效價大于1：64 000，且與其他禽類病毒無交叉反應(yīng)，證明其特異性良好，可以用于后續(xù)夾心ELISA方法的建立。單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果表明2C1的重鏈為IgM。由于IgM通常以五聚體的形式存在，且容易聚集，在高鹽和低鹽溶液中溶解度都不高，因此純化方法有別于IgG。Mahassni S H等［13］研究發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)上清中抗牛凝血素的小鼠IgM單抗最佳的純化方法是離子交換層析，而腹水中的最佳純化方法是G-100凝膠過濾。曹軍平等［10］研究發(fā)現(xiàn)利用PEG6000沉淀法純化的單抗較純凈，且活性損失少。綜合成本和時間因素，本研究選用PEG沉淀法進行2C1腹水的純化。而鴨新城疫病毒多克隆抗體的純化，本研究參考 McKinney M M 等［11］和曹軍平等［10］的研究，選擇了辛酸-硫酸銨法進行了純化。對純化前后的樣品進行SDS-PAGE（圖2），結(jié)果顯示純化效果良好，去除了雜蛋白，且重鏈和輕鏈分子量大小符合預(yù)期。

在選擇夾心ELISA中的包被抗體時，用純化后的腹水2C1和純化的鴨新城疫病毒多克隆抗體分別包被酶標板，進行ELISA預(yù)試驗。結(jié)果表明，當(dāng)2C1作為包被抗體，抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作為第二抗體時，才能獲得較高的P／N值。方陣試驗表明，當(dāng)2C1包被濃度為4μg／孔，鴨新城疫病毒尿囊液1∶10稀釋，抗鴨新城疫病毒多克隆抗體作用濃度為0.1μg／孔，HRP標記的羊抗兔酶標抗體1∶10 000倍稀釋，每種成分作用1h時，P／N比值最高。特異性試驗表明所建立的鴨新城疫病毒檢測方法不與IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 發(fā)生交叉反應(yīng)。該ELISA方法比傳統(tǒng)HA試驗方法至少敏感64倍，可以檢測出0.2μg的純化病毒。吳紅專等［6］研 制 的 PEG-ELISA 試 劑 盒 的 敏 感 性 為0.25ng～0.5ng的純化病毒，比本研究的結(jié)果高出800倍，這可能與單抗親和力及PEG具有沉淀免疫復(fù)合物的作用有關(guān)。因此，高親和力的單抗是試劑盒研制成功的關(guān)鍵。

小樣本人工感染樣本檢測結(jié)果表明，本研究所建立的夾心ELISA方法與病毒分離的符合率為91.7%。由于所取樣本有限，后續(xù)試驗需擴大樣本檢測數(shù)量，以便評價本研究建立方法的實用性。ELISA和病毒分離的結(jié)果表明，感染后的SPF雞排毒高峰在3d～5d，這與文獻報導(dǎo)類似［14］。由于雙抗體夾心ELISA試驗中參與反應(yīng)的成分多，非特異性反應(yīng)很難完全消除。本研究在檢測含大量糞便的拭子時，ELISA檢測結(jié)果存在偏高的現(xiàn)象，其原因尚待進一步研究。目前，能夠進行鑒別診斷的單抗夾心ELISA方法尚不多見［6，15］，且 ELISA 呈陽性者不全是強毒力株，還有中等毒毒力株或弱毒力株［16］。因此，鑒別診斷ELISA方法是今后研究的重點。

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