郝明飛，張 琳，胡北俠，崔言順，張秀美＊

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100）

自2010年4月以來，我國(guó)東南部分省份（包括山東、江蘇、浙江、廣西等）很多鴨場(chǎng)暴發(fā)了一種以產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降為主要特征的傳染病，給中國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失，后來證實(shí)該病是由黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類恩塔亞病毒群中的鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）所引起［1-3］。

鴨坦布蘇病毒的病毒粒子直徑40nm～50nm，有脂質(zhì)囊膜。病毒基因組為單股正鏈RNA，大小為10.9kb。5′端和3′端各有一非編碼區(qū)，其余基因?yàn)橐粋€(gè)開放閱讀框，從5′-3′依次編碼C蛋白（核衣殼蛋白）、prM／M 蛋白（囊膜蛋白）、E 蛋白（包膜蛋白）、非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1-NS2-NS3-NS4-NS5［4］。其中E基因全長(zhǎng)1 503bp，氮端含有的內(nèi)部信號(hào)肽，為prM／M基因的一部分［5］。E蛋白是黃病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒吸附、與宿主細(xì)胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要的作用。同時(shí)E蛋白也是黃病毒主要的病毒抗原，含有多種抗原表位，可通過誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答［6-8］。

本研究對(duì)鴨坦布蘇病毒E基因進(jìn)行了克隆表達(dá)、免疫原性的檢測(cè)，并初步建立了快速檢測(cè)DTMUV抗體的間接ELISA方法，為該病的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌種及質(zhì)粒 鴨坦布蘇病毒毒株由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存；E.coli DH5α、BL21（DE3）為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pMD18-T vector為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；原核表達(dá)載體pET-21a（＋）為山東省動(dòng)物疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要酶和試劑 RT-PCR一步法試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、DNA純化試劑盒、His·Bind Purification Kit、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNA Marker、X-gal、IPTG、EcoRⅠ酶、XhoⅠ酶、T4DNA連接酶，以及r Taq DNA聚合酶均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；ECL顯色試劑盒為Novagen公司產(chǎn)品；鴨坦布蘇病毒陽性血清由山東省動(dòng)物疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備和保存；HRP標(biāo)記的山羊抗鴨IGg為KPL公司產(chǎn)品；TMB顯色液為武漢博士德公司產(chǎn)品；ELISA酶標(biāo)板為北京朋遠(yuǎn)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 SPF鴨 SPF鴨種蛋購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，由山東省家禽所孵化場(chǎng)孵化。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)E基因表達(dá)引物E exp-1：CCGGAATTCTTCAGCTGGCTGGGCATG CAGAA（包含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），E exp-2：CCGCTCGAGGGCATTGACATTTACTGCCAGG（包含XhoⅠ酶切位點(diǎn)）由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA的提取 按常規(guī)方法從鴨胚尿囊液中提取病毒RNA。

1.2.3 基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 以RNA為模板，按常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括10×Ex Taq buffer 5μL，dNTP（2.5mmol／L）4μL，上游引物和下游引物（100pmol／μL）各1μL，Ex Taq酶1μL，病毒cDNA一鏈1μL，ddH2O補(bǔ)足50μL。擴(kuò)增程序如下：97℃5min；94℃50s，53℃50s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，16℃終止反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖電泳鑒定，對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行切膠回收，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，獲得E片段與經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET-21a（＋）載體，用T4DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），涂布含有100 mg／L氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確后，獲得含目的片段的陽性重組質(zhì)粒命名為PET21a-E。陽性質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 對(duì)篩選出陽性重組質(zhì)粒的單菌落，接種于氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.8mmol／L的IPTG，于37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體收集后超聲波破碎，12 000r／min離心20min，收集上清液和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western blot分析 按照His·Bind Purification Kit說明書進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的純化。將需要純化的溶液加入到已平衡好的Ni＋柱中，收集洗脫液，即為含有目的蛋白的純化液。按文獻(xiàn)［9］介紹的Western blot方法分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.6 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.2.6.1 ELISA操作步驟 將純化后的E蛋白用包被液稀釋后，包被到酶標(biāo)板上，100μL／孔，37℃作用2h后置于4℃過夜（10h～12h）；用PBST洗滌3次，每孔200μL；加入20mL／L BSA封閉液，200 μL每孔，37℃封閉2h；洗滌3次，加入一定稀釋倍數(shù)的陽性血清和陰性血清，100μL／孔，37℃作用2h；洗滌3次，加入1∶2 000稀釋的酶標(biāo)抗體，100 μL／孔，37℃作用2h；洗滌同以前，加入TMB底物液，每孔100μL，避光顯色5min～20min后，加入2 mol／L H2SO4（100μL／孔）終止反應(yīng)，立即于 450 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀中測(cè)OD450nm值，求出P／N值。

P／N=（被檢血清OD450nm值-空白對(duì)照OD450nm值）／（陰性血清OD450nm值-空白對(duì)照OD450nm值）

1.2.6.2 抗原包被濃度及抗體稀釋度的確定 以純化的重組E蛋白為包被抗原，將重組蛋白測(cè)定濃度后用包被液按1∶20倍比稀釋到1∶160，每孔100μL包被96孔板，37℃作用2h后置于4℃過夜；常規(guī)方法洗滌、封閉后，將陰性和陽性血清分別按1∶80倍比稀釋到1∶640，倍比稀釋，每孔100 μL，組成方陣，HRP-山羊抗鴨IgG按1∶2 000稀釋，37℃反應(yīng)2h，后面步驟按常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定，分別確定最佳抗原包被濃度及血清的最佳稀釋倍數(shù)［10］。

1.2.6.3 間接ELISA方法的優(yōu)化 參照文獻(xiàn)［11］的方法分別對(duì)酶標(biāo)二抗作用濃度、血清作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗作用時(shí)間及底物最佳作用時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.6.4 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 按照已經(jīng)確立的ELISA方法對(duì)收集的30份陰性血清樣品進(jìn)行測(cè)定，每份樣品重復(fù)3孔，計(jì)算樣本OD450nm值的平均值（ˉX）及標(biāo)準(zhǔn)差（SD），根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則：陰陽性臨界值=ˉX＋2SD，計(jì)算出臨界值，從而確定判定標(biāo)準(zhǔn)，大于此值判為陽性，小于此值判為陰性［12-13］。

1.2.6.5 特異性試驗(yàn) 在相同條件下，用建立的間接ELISA方法分別檢測(cè)鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨病毒性肝炎病毒（DHV）、鴨源新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、番鴨呼腸病毒（ARV）、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDSV）陽性血清，每份樣品重復(fù)3孔，以驗(yàn)證本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法是否對(duì)其他病毒的陽性血清有交叉反應(yīng)性，對(duì)該方法的特異性進(jìn)行分析。

1.2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 用同時(shí)包被和不同時(shí)包被的酶標(biāo)板對(duì)不同抗體水平的6份血清樣品（包括3份陽性血清，3份陰性血清）分別進(jìn)行4次批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測(cè)，按照參考文獻(xiàn)［14］進(jìn)行，計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)，分析結(jié)果有無明顯差異。

1.2.6.7 初步應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè) 應(yīng)用已建好的ELISA方法對(duì)采自山東各地區(qū)的120份鴨血清進(jìn)行檢測(cè)并分析檢測(cè)結(jié)果，分析鴨坦布蘇病毒的感染情況。

2 結(jié)果

2.1 PET21a-E重組質(zhì)粒的構(gòu)建

RT-PCR擴(kuò)增出E全長(zhǎng)基因，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，與同樣經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的PET-21a經(jīng)凝膠回收純化后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切得到5 400bp和1 500bp的片段，電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。將陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序，結(jié)果表明E基因片段已成功連接到pET-21a載體中。

圖1 pET21a-E酶切鑒定圖Fig.1 pET21a-E enzyme digestion

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

將轉(zhuǎn)化pET21a-E的BL21菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在55ku位置處有明顯表達(dá)帶，目的蛋白主要出現(xiàn)在細(xì)菌超聲裂解后離心沉淀物中（圖2）。

2.3 E蛋白的純化及Western blot結(jié)果

表達(dá)的E蛋白經(jīng)鎳柱親和純化后SDS-PAGE電泳檢測(cè)，獲得均一的重組蛋白，純化的E蛋白經(jīng)Western blot分析（圖3），結(jié)果顯示在55ku附近有一條清晰的蛋白印跡，說明表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性。

2.4 間接ELISA方法的建立

2.4.1 抗原與血清最佳稀釋度的確定 用蛋白測(cè)定儀測(cè)得純化后的E蛋白濃度為0.28mg／mL。方陣顯示（表1），當(dāng)抗原的稀釋濃度為1∶40，即包被抗原的濃度為7μg／mL時(shí)，血清的稀釋度為1∶320，陽性血清的OD450nm值可達(dá)0.532 6，而陰性血清的OD450nm值為0.186 4，陰性與陽性血清的OD450nm值相差最大（P／N=2.857 3）。因此，7μg／mL為抗原的最佳包被濃度，1∶320為最佳血清稀釋度。

圖2 E蛋白表達(dá)產(chǎn)物存在形式的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the existence of the fusion protein

圖3 重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE及其免疫印跡分析Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of purified recombinant protein

表1 E抗原和血清最佳稀釋度的方陣試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of optimal dilutions of Eantigen and serum by checkerboard titration（E）

2.4.2 最佳酶標(biāo)抗體工作濃度的優(yōu)化 用0.05 mol／L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）將抗原作稀釋至7 μg／mL后包被酶標(biāo)板，37℃作用2h后4℃過夜。血清作1∶320稀釋，將酶標(biāo)抗體做500、1 000、2 000、4 000倍稀釋，100μL／孔，按照2.5.1ELISA方法進(jìn)行操作，記錄結(jié)果（表2）。試驗(yàn)確定最佳酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶1 000倍稀釋。

表2 最佳酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇Table 2 Optimization of enzyme-labled antibody dilutions

2.4.3 最佳被檢血清和酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳被檢血清作用時(shí)間為37℃孵育2h（表3），最佳酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的為37℃孵育1h（表4）。

表3 最佳被檢血清作用時(shí)間的選擇Table 3 Optimization of serum incubation time

2.4.4 最佳顯色時(shí)間的優(yōu)化 本試驗(yàn)最終確定最佳顯色條件為室溫（20℃），顯色10min（表5）。

2.4.5 判定標(biāo)準(zhǔn)的確立 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的30份鴨血清（已知DTMUV陰性血清），按上述已優(yōu)化完成的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。求平均值（ˉX）為0.206 8，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為0.058 8，根據(jù)公式：陰陽性臨界值=ˉX＋2SD，試驗(yàn)臨界值為0.324 4。即待測(cè)樣品的OD450nm值≥0.324 4時(shí)為陽性，OD450 nm值＜0.324 4則為陰性（圖4）。

表4 最佳酶標(biāo)抗體作用時(shí)間的選擇Table 4 Optimization of reation time of labled antibody

表5 最佳顯色時(shí)間的確定Table 5 Determination of substrate reaction time

2.4.6 特異性試驗(yàn)結(jié)果 用建立的間接ELISA方法對(duì)禽流感病毒、番鴨呼腸病毒、鴨源新城疫病毒、鴨病毒性肝炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和鴨坦布蘇病毒的陽性血清進(jìn)行測(cè)定，其OD450nm值分別為0.179 1、0.212 8、0.112 8、0.133 7、0.205 6、0.136 9和0.816 7，其他病毒的陽性血清OD450 nm值均小于陰陽性臨界值0.324 4，表明建立的間接ELISA方法具有較好的特異性［15］。

2.4.7 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 取6份不同的血清樣品進(jìn)行4次批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)（表6），檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)不超過9%，說明建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

圖4 30份鴨陰性血清間接ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The detection results of 30negative serum samples by indirect ELISA

表6 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)Table 6 The repeat test of ELISA within a batch

2.4.8 批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 批間重復(fù)性試驗(yàn)是將不同批次抗原按相同濃度包被酶標(biāo)板，分別用4個(gè)不同批次凍存包被的酶標(biāo)板來作重復(fù)檢測(cè)，其4次檢測(cè)結(jié)果基本一致，變異系數(shù)控制在10%以下，表明同一樣品在不同批次抗原試驗(yàn)中變異程度很小，具有良好的重復(fù)性。

2.4.9 樣品檢測(cè)結(jié)果 按建立的ELISA方法，檢測(cè)采自山東各地區(qū)的鴨血清120份，其中陽性22份，陰性98份。

3 討 論

鴨坦布蘇病毒自2010年發(fā)病以來給中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，由于是新發(fā)黃病毒病，基因信息較少，各蛋白基因分割位點(diǎn)還不是很明確，加之活力較低，滴度下降快，給病毒檢測(cè)和疫苗研制帶來了極大的難度。

E蛋白是坦布蘇病毒體外中和作用的主要靶點(diǎn)和病毒特異性抗體的作用位點(diǎn)，具有中和活性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體引發(fā)特異性免疫。黃病毒E蛋白可在宿主細(xì)胞表面變構(gòu)形成二聚體或三聚體侵入宿主細(xì)胞并與毒力密切相關(guān)［16］。本研究在多次嘗試不同表達(dá)載體之后，采用pET系統(tǒng)成功地構(gòu)建了E蛋白的原核表達(dá)載體，并高效表達(dá)了鴨坦布蘇病毒E蛋白，重組蛋白大部分以包涵體形式存在，上清中的量很少。Western blot分析結(jié)果表明，表達(dá)的E蛋白能與抗鴨坦布蘇病毒的多抗結(jié)合，表明其具有較好的反應(yīng)原性。

間接ELISA是血清學(xué)檢測(cè)的常用方法，其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，靈敏度高及檢測(cè)速度快。在建立間接ELISA方法過程中，抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的確定是關(guān)鍵［10］，本研究通過方陣法確定了抗原的最佳包被濃度為7μg／mL，最佳血清稀釋度為1∶320。在一定條件下（pH、離子強(qiáng)度）下，為了將固化在酶標(biāo)板上的蛋白質(zhì)將被折疊包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水區(qū)暴露出來，從而保持其作為檢測(cè)抗原有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，本研究采用了0.05 mol／L（pH9.0）的碳酸鹽緩沖液作為包被液。間接ELISA結(jié)果的判定方法有多種，如P／N法，終點(diǎn)法和單稀釋法等。本研究采用P／N法，如果被檢血清的值在0.324 4以上判為陽性，在其以下則判為陰性。在顯色時(shí)間的優(yōu)化中，最終選擇室溫下10 min，雖然OD值較1.0距離稍大，但其P／N最大，而顯色20min雖然其P／N較大且OD值較接近于1.0，但其陽性、陰性O(shè)D值均過高，且經(jīng)過試驗(yàn)比較變異系數(shù)較大，因此不予選擇。該方法中所用的檢測(cè)試劑（包被液、封閉液等）尚未標(biāo)準(zhǔn)化，所以本研究對(duì)所建立的間接ELISA方法未做其敏感性試驗(yàn)，今后將更進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，以便能夠更快的檢測(cè)該病毒的血清抗體。

本研究探討了利用重組蛋白作為包被抗原，并初步建立了快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒抗體的間接ELISA方法，實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)血清鴨坦布蘇病毒抗體的可行性，為鴨坦布蘇病毒血清學(xué)監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)手段。

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