劉沫飛，李 蕾，鄭 輝，李 嵐，王賽賽，吳發(fā)興，李曉成，王洪斌，黃保續(xù)＊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150036；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明650201；4.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的高度接觸性傳染?。?-2］，臨床癥狀主要為妊娠母豬流產(chǎn)、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙以及各種年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病，俗稱豬藍(lán)耳?。?］。PRRSV屬動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）、動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus），基因組全長(zhǎng)約15kb，包括9個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），每個(gè)開放閱讀框都有不同程度的重疊，分別編碼病毒復(fù)制酶、糖蛋白、膜蛋白（M蛋白）和核衣殼蛋白（N蛋白）［4］。1987年在美國(guó)首先發(fā)現(xiàn)此病，1991年在荷蘭首次分離到病原，命名Lelystad virus（LV ）［5］。1992年美國(guó)學(xué)者分離到該病毒，命名為 ATTC VR-2332（Wensvoort，1993）［6］。我國(guó)首次報(bào)道是在1996年，由郭寶清分離到PRRSV。根據(jù)抗原性及基因序列差異將病毒分為歐洲型（原型毒株為L(zhǎng)V）和美洲型（原型毒株為VR-2332）兩大類，歐洲型PRRSV主要流行于歐洲地區(qū)，而美洲型PRRSV主要流行于美洲和亞太地區(qū)［7］，兩者核苷酸序列同源性約為60%，其中ORF5同源性僅為54%。豬是PRRSV的惟一天然宿主，血清學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明野豬同樣也可自然感染。各種年齡段的豬只都可被感染，尤其妊娠母豬和仔豬更加易感。但在人工感染試驗(yàn)中，部分禽類（如綠頭鴨）對(duì)PRRSV特別易感，但是屬于無癥狀感染［8］。

本病的流行給全球養(yǎng)豬行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，特別是我國(guó)2006年發(fā)生的高致病性PRRS［9］，由于其變異程度較大，造成豬群大批量死亡。本研究通過對(duì)2010年-2011年分離自我國(guó)部分省的PRRSV，通過對(duì)PRRSV的分離鑒定以及ORF5的基因序列進(jìn)行分析，了解我國(guó)部分省PRRSV感染情況和基因的變異情況，研究毒株的遺傳演化特點(diǎn)，為我國(guó)本病防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集于我國(guó)遼寧（LN）、河北（HB）、河南（HN）、山東（SD）、安徽（AH）五省不同類型的發(fā)病豬場(chǎng)的疑似發(fā)病樣品和屠宰場(chǎng)的樣品15份，樣品為豬的肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織。

1.1.2 細(xì)胞 Marc-145細(xì)胞，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心檢測(cè)室保存，外源病原檢測(cè)結(jié)果為純凈。1.1.3 菌株與克隆載體 PGEM-TEasy載體克隆試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，DH 5α大腸埃希菌為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基，新生小牛血清為Hy Clone公司產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV 酶、RNA 酶 抑 制 劑、DNA Marker DL 2 000、DNA Marker DL 15 000、r Taq 酶、dNTP、BamHⅠ及HindⅢ限制性內(nèi)切酶均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理方法 無菌操作剪取2.0g組織，加入少量的DMEM（含青霉素、鏈霉素1 000U），研磨至糊狀，再加入3倍體積的DMEM稀釋成懸濁液，分裝到無菌離心管中，樣品在-80℃和37℃反復(fù)凍融3次，置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中收錄的PRRSV JXA1、VR-2332、CH-1a、HUB1的基因序列，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增ORF5（603bp）基因全序列的特異性引物。

1.2.3 病毒分離 將凍存的組織懸液10 000 r／min離心5min，取上清液1mL，用0.22μm濾器過濾除菌，接種到單層的Marc-145細(xì)胞，37℃吸附1.5h后，加入6mL細(xì)胞維持液（含20mL／L新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基），將培養(yǎng)瓶置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，觀察記錄病變，待約75%的細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE（約72h～96h）收獲病毒。置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PRRSV總RNA提取 按Invitrogen公司的Trizol reagent RNA提取試劑盒操作說明書，提取病毒基因組總RNA。將處理好的樣品每份取250μL，然后加750μL Trizol，劇烈混勻，室溫放置5min；再加入200μL氯仿，振蕩混勻，4℃放置10min；12 000 r／min、4℃離心15min；取上清500μL，加等體積低溫的異丙醇，混勻，室溫靜置10min，12 000r／min、4℃離心12min；棄上清，加入1mL濃度為750mL／L的乙醇（DEPC處理過的），7 500r／min離心5min；棄上清，倒置20min后，用20μL的DEPC處理水溶解，置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PRRSV RT-PCR檢測(cè) 反轉(zhuǎn)錄體系：取5μL RNA，5×reverse transcripatase buffer 4μL、dNTP mixture（2.5mmol／L）4μL、RNaseinhibitor 0.5μL、AMV reverse transcrpatase 0.5μL、下游引物1μL（20pmol／μL）、DEPC處理水加至20μL。反應(yīng)條件為，42℃水浴1.5h，即得cDNA 模板。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板3μL、10×PCR buffer 2.5μL、dNTP mixture（2.5mmol／L）2.0μL、ExTaq0.5μL、上、下游引物 PF／PR 各0.5μL，DEPC處理水加至25μL。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠、150V電壓40min電泳檢測(cè)。1.2.6 序列分析 用DNA Star中軟件對(duì)所獲得的15株P(guān)RRSV分離株ORF5基因序列進(jìn)行比較分析，與國(guó)內(nèi)已發(fā)表的CH-1a、BJ-4、JXA1、HB-1、HB-2、HUN4、CC-1、GD2007、YN2008、SX2009、S1、HuN06、Em2007、SD-JN、SD-LC1、SD-4、SD0612等毒株和國(guó)外已發(fā)表的標(biāo)準(zhǔn)株LV、VR-2332、MLV等19株參比毒株（表1），共34株毒株分別進(jìn)行核苷酸序列比較。

表1 本試驗(yàn)所用的ORF5基因參比毒株Table 1 The ORF5gene reference strains used in this study

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與鑒定

將我國(guó)5個(gè)省份（遼寧、河北、河南、山東、安徽）15株陽(yáng)性樣品接種到細(xì)胞后，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變（CPE）的樣品有15株。將樣品過濾后的組織懸液接種于Marc-145細(xì)胞，傳至第1代和第2代均未出現(xiàn)明顯的CPE，當(dāng)病毒傳代至第3代時(shí)開始出現(xiàn)CPE，病變特征為細(xì)胞折光性增強(qiáng)、細(xì)胞變圓、膨大，部分細(xì)胞發(fā)生聚堆現(xiàn)象呈葡萄串狀，隨后細(xì)胞發(fā)生皺縮、灶狀脫落，最后出現(xiàn)大片空泡，符合PRRSV感染Marc-145細(xì)胞所出現(xiàn)的典型CPE。

2.2 分離毒株目的基因的擴(kuò)增

對(duì)經(jīng)Marc-145細(xì)胞增殖的15個(gè)分離毒進(jìn)行ORF5基因的RT-PCR擴(kuò)增，獲得了與預(yù)期大小相符的特異性片段（圖1）。

圖1 PRRSV陽(yáng)性樣品的ORF5擴(kuò)增Fig.1 Amplification of ORF5gene PRRSV positive samples

2.3 目的基因序列測(cè)定及比對(duì)分析

經(jīng)送樣測(cè)序獲得15株ORF5序列，測(cè)序結(jié)果經(jīng)登陸GenBank進(jìn)行比對(duì)分析，證實(shí)皆為PRRSV的基因序列。

2.3.1 分離株ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析 通過DNA Star軟件分析，測(cè)得的15個(gè)分離株的ORF5基因所推導(dǎo)氨基酸序列之間的同源性95.5%～99.5%，遼寧4株分離株之間的同源性為96.5%～99.5%，河南3株分離株之間的同源性96.5%～98.5%，安徽2株分離株之間的同源性為96.0%，河北2株分離株之間的同源性為98.0%，山東4株分離株之間的同源性為96.0%～97.5%。與VR2332（美洲型代表株）、MLV（疫苗株）、CH-1a（中國(guó)代表毒株）、JXA1（高致病株）、HB-1和 HB-2的ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為86.1%～88.6%、85.6%～87.6%、90.5%～92.0%、97.5%～98.5%、92.0%～95.5%和88.6%～90.0%，與國(guó)內(nèi)其他毒株 HEB1、CC-1、HuN06、SDJN、SD-4的ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為97.5%～98.5%、85.1%～87.1%、97.0%～98.5%、97.5%～98.5%、96.5%～99.0%，15株P(guān)RRSV分離株與歐洲性代表毒株LV ORF5同源性為63.5%～64.4%。

2.3.2 分離株ORF5基因推導(dǎo)氨基酸序列的變異性分析 應(yīng)用DNA Star軟件中的Protean軟件對(duì)15個(gè)分離株ORF5基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行分析，15個(gè)分離株的ORF5基因編碼200個(gè)氨基酸，國(guó)內(nèi)外參考毒株相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所測(cè)的分離株的GP5蛋白存在部分氨基酸的突變，分離株ORF5基因編碼蛋白GP5的推導(dǎo)氨基酸序列的變異主要發(fā)生在9位～39位。GP5氨基酸序列的第13位和第151位被認(rèn)為是與毒力相關(guān)的位點(diǎn)，15個(gè)分離株的GP5第13位的R13位均未發(fā)生變異，第151位有BFHB1-2011 株、BFHB2-2011 株、BFHN1-2011株、BFHN3-2010株、BFLN1-2010株、BFLN1-2011株、BFLN2-2010株、BFSD1-2010株、BFSD2-2011株9個(gè)分離株發(fā)生R151→K151的突變，突變結(jié)果與參比序列HN1一致，其余6株的R151沒發(fā)生突變，這與BJ-4、CC-1、S1和MLV等弱毒株或疫苗毒株的R151→G151不同，證明分離株為強(qiáng)致病性毒株。同時(shí)，所有毒株均發(fā)生A137→S137的突變。目前已確定的GP5抗原表位中包括3個(gè)B細(xì)胞表位和2個(gè)T細(xì)胞表位［10］。B細(xì)胞表位中，第1個(gè)表位（27aa～30aa）是影響免疫的關(guān)鍵表位，為非中和表位，又稱誘騙表位（decoy epitope）［11］，本研究所獲得的15個(gè)分離株中BFAH2-2011、BFLN3-2010和BFSD1-2011發(fā)生V29→A29突變；第2個(gè)表位（37aa～45aa）是 GP5的主要中和表位（primary neutralizingepitope，PNE），15個(gè)分離株均未發(fā)生突變；第3個(gè)表位（180aa～197aa）是非中和表位，15個(gè)分離株變異較大，其中BFAH1-2010株、BFHB2-2011株、BFHN1-2010株、BFHN1-2011株、BFSD2-2010株、BFSD2-2011株發(fā)生Q196→L196突變，突變后與JXA1一致，BFHB1-2011株、BFHN3-2010株、BFLN1-2010株、BFLN1-2011 株、BFLN2-2010株、BFSD1-2010株發(fā)生 Q196→R196，而BFSD1-2011株、BFLN3-2010株、BFAH2-2011株未發(fā)生突變。T細(xì)胞表位中，所有毒株在第一個(gè)表位（117aa～131aa）均未發(fā)生突變。另外15個(gè)分離株137位aa全部為S，與疫苗（MLV）株的137位aa不同，說明本研究所獲得分離株均為野毒株。

2.3.3 GP5遺傳進(jìn)化分析 依據(jù)DNA Star軟件中的Meg Align，對(duì)ORF5基因序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2，將測(cè)得15株P(guān)RRSV的ORF5基因序列與國(guó)內(nèi)外代表毒株進(jìn)行對(duì)比分析，根據(jù)結(jié)果可以將PRRSV分為歐洲型和美洲型兩個(gè)基因型，其中美洲型又可以分為2亞群，所獲得的PRRSV分離株與VR2332遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，BFLN1-2010等12個(gè)分離株與HUB1和JXA1親緣關(guān)系比較近，處于一個(gè)亞群；而 BFLN3-2010、BFAH2-2011、BFSD1-2011與CH-1a遺傳距離較近。

圖2 ORF5基因序列遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ORF5gene sequence

3 討論

本研究采用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。PRRSV通過標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)噬途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，并引起被感染細(xì)胞的凋亡［12］。PRRSV不具有血凝活性，不能夠凝集哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞。RTPCR鑒定為PRRSV陽(yáng)性樣品，經(jīng)過濾除菌后，接種到Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞傳代，第1代細(xì)胞毒CPE不明顯，第2代細(xì)胞毒逐步出現(xiàn)細(xì)胞CPE，當(dāng)傳代到第3代時(shí)CPE趨于穩(wěn)定。細(xì)胞病變主要表現(xiàn)為：一般在接種48h后可產(chǎn)生明顯CPE，細(xì)胞發(fā)生皺縮、聚堆；72h后出現(xiàn)灶狀脫落、折光性增強(qiáng)；96h后大量脫落死亡，形成大片空洞。PRRSV對(duì)存在環(huán)境的要求較為苛刻，細(xì)胞感染性受溫度、濕度和pH影響，同時(shí)對(duì)有機(jī)溶劑敏感。所以在分離PRRSV時(shí)要盡量選取病毒含量較高的臟器（肺臟、淋巴結(jié)），同時(shí)要保證新鮮程度，并且要在低溫環(huán)境下操作，以避免病毒失活。

ORF5基因是病毒的主要結(jié)構(gòu)，其基因編碼病毒的囊膜蛋白GP5，也是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，GP5蛋白在病毒感染動(dòng)物機(jī)體方面顯示出重要的作用［13］。GP5有特定的親水區(qū)和糖基化位點(diǎn)，該蛋白內(nèi)部有一段疏水區(qū)，可能起到錨定膜的作用［14］。目前研究表明與抗體依賴性增強(qiáng)作用（ADE）相關(guān)的蛋白主要為N蛋白和GP5蛋白，而GP3蛋白和 M 蛋白誘導(dǎo)的抗體不具有ADE［15］。ORF5屬于PRRSV基因組中高變區(qū)，GP5是PRRSV主要的宿主保護(hù)性抗原。根據(jù)血清學(xué)可將PRRSV分為美洲型和歐洲型，兩型毒株間核苷酸和氨基酸序列同源性差別較大，同型毒株之間ORF5的核苷酸和氨基酸序列同源性也存在差別［16］。15株P(guān)RRSV毒株間ORF5基因所推導(dǎo)氨基酸序列的同源性95.5%～99.5%，遼寧4株分離株之間的同源性96.5%～99.5%，河南3株分離株之間的同源性96.5%～98.5%，安徽2株分離株之間的同源性為96.0%，河北2株分離株之間的同源性為98.0%，山東4株分離株之間的同源性為96.0%～97.5%。與VR2332（美洲型代表毒株）、MLV（疫苗毒株）、CH-1a（中國(guó)代表毒株）、JXA1（高致病性毒株）、HB-1和HB-2的ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為86.1%～88.6%、85.6%～87.6%、90.5%～92.0%、97.5%～98.5%、92.0%～95.5%和88.6%～90.0%，與國(guó)內(nèi)其他毒株 HEB1、CC-1、HuN06、SD-JN、SD-4的 ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為97.5%～98.5%、85.1%～87.1%、97.0%～98.5%、97.5%～98.5%、96.5%～99.0%。本次研究所獲得15株P(guān)RRSV均屬于美洲型毒株。

GP5蛋白含有2～4個(gè)糖基化位點(diǎn)，具有一個(gè)由31個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。以往研究發(fā)現(xiàn)，美洲株N端的信號(hào)序列由前25氨基酸組成，這個(gè)區(qū)域可能存在3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別存在于30 aa～32aa，44aa～46aa，51aa～53aa之間的氨基酸殘基處，是歐洲株和美洲株高度變異的區(qū)域。GP5氨基酸序列中9aa～29aa這個(gè)區(qū)域變異最大［17］，在這個(gè)區(qū)域內(nèi)15個(gè)分離株的變異程度與JXA1株保持高度的相似。10個(gè)分離株氨基酸序列中的第23位為S，而JXA1株為F，另外有5個(gè)分離株氨基酸序列中的第29位為A，與JXA1株的V不同。說明獲得的15個(gè)分離株與JXA1株親緣關(guān)系較近。

GP5氨基酸序列的第13位和第151位被認(rèn)為是與毒力相關(guān)的位點(diǎn)，15個(gè)分離株的GP5第13位的R13位均未發(fā)生變異，第151位有9個(gè)分離株發(fā)生R151→K151的突變，突變結(jié)果與參比序列HN1一致。同時(shí)，所有毒株均發(fā)生A137→S137的突變。

B細(xì)胞表位中，兩個(gè)非中和表位發(fā)生V29→A29突變和Q196→L196突變，而主要中和表位，15個(gè)分離株均未發(fā)生突變，與JXA1一致。這些氨基酸的變異可能對(duì)GP5蛋白的結(jié)構(gòu)、親疏水性以及抗原性等造成影響，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體過程產(chǎn)生變化，可能降低抗原抗體中和作用，促使抗原逃避機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)［18］，進(jìn)而可能會(huì)增強(qiáng)病毒的致病性。

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