閔大六 沈贊 林峰 徐曉麗 黃文濤 姚陽

1. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，△病理科，上海 200233；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，其發(fā)病原因目前仍不清楚。Runx2是在骨母細(xì)胞分化和骨形成中起重要作用的基因，其在骨肉瘤中的作用還不甚清楚。Ezrin是細(xì)胞骨架連接膜蛋白，與多種惡性腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌等的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究擬通過檢測(cè)骨肉瘤組織中Runx2和Ezrin的表達(dá)，探討二者表達(dá)的相關(guān)性及其與臨床生物學(xué)行為之間的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2002年1月—2008年5月間臨床資料完整的骨肉瘤穿刺活檢組織石蠟樣本82例。術(shù)前均未作過任何化療或放療。所有病例均有完整的隨訪記錄，隨訪時(shí)間為3～88個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為42個(gè)月。

1.2 主要試劑及方法

鼠抗人Runx2單克隆抗體購自 Abnova公司，兔抗人Ezrin單克隆抗體購自Dako公司。所有組織均為10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫鈣，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，免疫組化采用SP法，按試劑盒說明操作。以隨試劑盒提供的已知陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，以陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)占同類細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)作為計(jì)數(shù)點(diǎn)，取其平均值為該病例的細(xì)胞陽性率，并據(jù)此對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分：陽性細(xì)胞率<10%為0分；陽性細(xì)胞率11%～25%為1分；陽性細(xì)胞率26%～50%為2分；陽性細(xì)胞率>5 0%為3分。同時(shí)根據(jù)染色強(qiáng)度加以評(píng)分，無著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。最后根據(jù)陽性細(xì)胞率與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積進(jìn)行最后評(píng)分，0分為陰性，≥1分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)與Fisher確切概率檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。生存分析采用Kaplan-Meier方法，Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤樣本資料的臨床特征

本研究82例骨肉瘤患者中，男性44例、女性38例。年齡7～62歲，其中20歲以上為26例，中位年齡19歲。病變發(fā)生于肢體61例，其中股骨35例、脛骨18例、肱骨6例，腓骨2例；發(fā)生于軀干21例，其中骨盆10例，上頜骨4例，跟骨4例，椎體2例，肋骨1例。組織類型為普通型75例，其中骨母細(xì)胞性骨肉瘤27例，軟骨母細(xì)胞性骨肉瘤23例，纖維母細(xì)胞性骨肉瘤17例，其他亞型8例；非普通型7例，其中血管擴(kuò)張性骨肉瘤3例，去分化骨旁骨肉瘤2例，小細(xì)胞骨肉瘤2例。按照Eneeking分期，Ⅱ期55例，Ⅲ期(均合并肺轉(zhuǎn)移)27例。堿性磷酸酶(ALP)正常50例，ALP升高32例。

2.2 骨肉瘤組織中Runx2蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系

本研究82例骨肉瘤組織中Runx2陽性表達(dá)54例，陽性率為65.9%。Runx2陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核(圖1A)。分析Runx2與骨肉瘤臨床參數(shù)關(guān)系顯示，Runx2陽性表達(dá)與年齡、性別、部位、組織類型、ALP水平無關(guān)(P>0.05)，而與臨床分期相關(guān)，Eneeking分期為Ⅲ期(有肺轉(zhuǎn)移)的患者Runx2蛋白陽性表達(dá)率為100.0%，顯著高于無肺轉(zhuǎn)移者(49.1%，P<0.01，表1)。

圖1 Runx2和Ezrin在骨肉瘤組織中的表達(dá)Fig.1 Runx2 (A) and Ezrin (B) expressions in osteosarcoma tissues(SP, ×200)

表1 骨肉瘤組織中Runx2表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between Runx2 expression and clinical factors in osteosarcoma

2.3 骨肉瘤組織中Ezrin蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系

本研究82例骨肉瘤組織中，Ezrin陽性表達(dá)者49例，陽性率為59.8%。Ezrin陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1B)。Ezrin陽性表達(dá)同樣與年齡、性別、部位、組織類型、ALP水平無關(guān)(P>0.05)，而與臨床分期相關(guān)，Eneeking分期為Ⅲ期(有肺轉(zhuǎn)移)的患者Ezrin蛋白陽性表達(dá)率為96.3%，顯著高于無肺轉(zhuǎn)移者(41.8%，P<0.01，表2)。

2.4 骨肉瘤組織中Runx2和Ezrin表達(dá)的相關(guān)性

82例骨肉瘤組織中Runx2與Ezrin均呈陽性表達(dá)者為48例，占所有病例的58.5%。Pearson相關(guān)分析顯示，Runx2與Ezrin的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.825，P<0.001，表3)。

2.5 Runx2和Ezrin表達(dá)與骨肉瘤生存期之間的關(guān)系

Runx2陽性表達(dá)者總生存期平均為(22.57±1.47)個(gè)月，中位總生存期為24個(gè)月，3年總生存率為13.7%；而Runx2陰性表達(dá)者總生存期平均為(41.41±3.21)個(gè)月，中位總生存期為46個(gè)月，3年總生存率為64.3%。Ezrin陽性表達(dá)者總生存期平均為(22.24±1.35)個(gè)月，中位總生存期為23個(gè)月，3年總生存率為12.5%；而Ezrin陰性表達(dá)者總生存期平均為(41.71±4.08)個(gè)月，中位總生存期為42個(gè)月，3年總生存率為67.7%。結(jié)果顯示，Runx2和Ezrin陽性表達(dá)者生存期顯著短于陰性表達(dá)者(P<0.001，圖2)。

表2 骨肉瘤組織中Ezrin表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between Ezrin expression and clinical factors in osteosarcoma

表3 骨肉瘤組織中Runx2和Ezrin表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 Relationship between Runx2 and Ezrin expression in osteosarcoma

圖2 Runx2和Ezrin表達(dá)對(duì)骨肉瘤患者總生存的影響Fig.2 Overall survival according to the expressions of Runx2 (A)and Ezrin (B) gene

3 討 論

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，其惡性程度高，在局部呈侵襲性生長(zhǎng)且易發(fā)生血行性肺轉(zhuǎn)移［1-2］。盡管近年來骨肉瘤的治療采用了手術(shù)聯(lián)合化療的多學(xué)科綜合治療，患者的預(yù)后有了明顯的改善，但5年總生存率仍只有60%［3］。近半數(shù)的骨肉瘤患者最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移［4-5］。

肺臟是骨肉瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見的部位，約占骨肉瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的90%［4］。骨肉瘤存在轉(zhuǎn)移器官和組織的特異性，但其確切機(jī)制目前還不甚清楚。肺轉(zhuǎn)移途徑是通過腫瘤細(xì)胞血管侵犯、轉(zhuǎn)移、定植形成的。近年研究發(fā)現(xiàn)，在機(jī)體中可能存在腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)移器官微環(huán)境之間的相互作用，并涉及到宿主細(xì)胞釋放的趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞分裂因子和生長(zhǎng)因子等因素的參與［6］。

Runx2是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族成員之一，為骨母細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在骨母細(xì)胞的發(fā)育、分化和骨形成過程中起著重要的作用［7］。本研究中，Runx2蛋白表達(dá)的陽性率為65.9%。進(jìn)一步分析顯示，Runx2陽性表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位、組織學(xué)類型、ALP水平均無關(guān)，而與臨床分期相關(guān)，有肺轉(zhuǎn)移者(Ⅲ期)Runx2陽性表達(dá)率顯著高于無肺轉(zhuǎn)移者(Ⅱ期)，提示Runx2蛋白可能參與了骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移過程。另外，本研究結(jié)果還顯示Runx2蛋白表達(dá)水平陰性與預(yù)后相關(guān)，Runx2陽性表達(dá)者的中位生存時(shí)間顯著短于Runx2陰性表達(dá)者。

Runx2參與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移形成的機(jī)制還不清楚。Pratap等［8］的研究顯示，在乳腺癌和前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞中Runx2激活了整合素，而后者是轉(zhuǎn)移途徑中重 要的因子之一。Zelzer等［9］研究顯示Runx2可能通過激活和調(diào)節(jié)VEGF參與腫瘤早期的血管形成，后者是血行性肺轉(zhuǎn)移的重要因子之一。Sun等［10］研究顯示Runx2影響骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，激活MMPs、膜蛋白以及血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)骨黏附，從而調(diào)節(jié)血管再生和腫瘤的生長(zhǎng)。Won等［11］在一組48例骨肉瘤樣本中也顯示Runx2的高表達(dá)和骨肉瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本研究結(jié)果相似。Runx2在肺轉(zhuǎn)移中的分子作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

Ezrin為細(xì)胞骨架連接膜蛋白，是ERM家族成員之一，生理狀態(tài)下參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移、黏附和有絲分裂等過程。研究顯示Ezrin基因與多種惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。Ezrin的過度表達(dá)及活化可導(dǎo)致細(xì)胞間信號(hào)傳遞異常，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中起作用。如Ezrin蛋白可以直接與細(xì)胞基質(zhì)透明質(zhì)酸受體CD44分子的胞質(zhì)部分發(fā)生作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；Ezrin還參與了MAPK和Akt信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本研究先前的研究發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白表達(dá)與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［13］。本研究中，Ezrin蛋白表達(dá)陽性率為59.8%。其陽性表達(dá)與年齡、性別、部位、組織類型、ALP水平無關(guān)，而仍與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移有關(guān)，且與Runx2表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示在骨肉瘤中Runx2和Ezrin可能存在相互協(xié)同作用，共同促進(jìn)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Runx2和Ezrin之間相互作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果還提示，Runx2和Ezrin蛋白表達(dá)水平可以作為骨肉瘤的預(yù)后因子，從而指導(dǎo)臨床預(yù)后的判斷。

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