李佩波，蔡敏泓，黃永茂，林 雁，鄒永勝，鐘 利，陳 楓，陳 莊，向成玉

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院感染科，四川 瀘州 646000）

大腸埃希菌屬于腸桿菌科，為革蘭陰性短桿菌，屬于條件致病菌，是臨床上常見的細菌感染之一。近年來，隨著β－內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等抗菌藥物在臨床上廣泛應用、不合理使用以及濫用，導致細菌出現(xiàn)了不同程度的耐藥，甚至出現(xiàn)了交叉耐藥和多重耐藥的特點［1］。Ⅰ類整合子在大腸埃希菌中廣泛存在，整合子相關耐藥基因在該菌耐藥性的形成和播散中發(fā)揮重要作用［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌耐藥情況嚴重，尤其是產ESBLs酶菌株更突出［3］。本研究對臨床分離的71株大腸埃希菌進行耐藥分析、ESBLs鑒定和Ⅰ類整合子遺傳標記檢測，并探討其相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗菌株:71株大腸埃希菌臨床分離株（不含同一病例相同部位重復分離株）來自瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院2007年10月至2008年10月期間感染大腸埃希菌的患者。其中呼吸道感染29例，泌尿系統(tǒng)感染18例，外科切口感染14例，全身感染8例，其他2例；全部菌株均重新經VITEK系統(tǒng)（BioMerieux，法國）鑒定確認。標準菌株:大腸埃希菌 ATCC 25922，購自國家臨床檢驗中心。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗 采用美國全國臨床檢驗標準委員會（NCCLS）推薦的紙片擴散法（K－B法）進行臨床常用3類6種（LVE、CIP、FOX、S、A）抗菌藥物的敏感性檢測，并根據(jù) NCCLS 2006要求進行敏感性判斷。

1.2.2 ESBLs鑒定 初步篩選試驗:選用頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢曲松藥敏紙片（杭州天和微生物試劑公司）對71株大腸埃希菌進行產ESBLs篩選試驗，凡頭孢他啶的抑菌環(huán)直徑小于或等于22mm，頭孢曲松小于或等于25mm，氨曲南或頭孢噻肟小于或等于27mm，則提示為可疑產ESBLs菌株。紙片確認試驗:將初篩可疑產ESBLs菌株同時用頭孢他啶和頭孢他啶加克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟加克拉維酸作藥敏試驗，對任何一組藥物，加克拉維酸前后抑菌環(huán)直徑相差大于或等于5mm可確認為產ESBLs菌株。

1.2.3 PCR技術檢測基因 采用Biospin細菌基因組DNA試劑盒（上海生工生物技術公司）提取大腸埃希菌DNA。根據(jù)Ⅰ類整合子遺傳標記qacE△sul1設計引物（上海生工生物技術公司提供）。上游引物基因序列P1:TAG CGA GGG CTT TAC TAA GC；下游引物基因序列P2:ATT CAG AAT GCC GAA CAC CG。

以提取的大腸埃希菌DNA為反應模板進行PCR擴增。所有PCR反應體系均為25μL，其中2×Taq PCR MasterMix組成包括:0.1U／μL聚合酶，500mmol／L dNTP，20mmol／L Tris－HCl（pH 8.3），100mmol／L KCl，3mmol／L MgCl2等。PCR擴增條件:94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30個循環(huán)，然后72℃延伸5min。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、紫外線檢測儀觀察結果，并將擴增產物送至上海生工生物技術公司進行基因測序。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有實驗結果均采用SPSS13.0錄入建立數(shù)據(jù)庫并行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用χ2檢驗。當T＜1或N＜40時用確切概率法計算P值；若1≤T＜5且N≥40時用連續(xù)校正法處理。

2 結 果

2.1 藥物敏感試驗結果 71株臨床分離的大腸埃希菌對6種抗生素耐藥情況分別為:左氧氟沙星45株、環(huán)丙沙星51株、頭孢噻肟44株、頭孢西丁9株、鏈霉素41株、阿米卡星6株。其中耐藥率最高為環(huán)丙沙星72.86%，最低為阿米卡星8.57%。不同耐藥模式中以耐多藥最多為45株（64.29%），全敏最少為7株（9.86%）。

2.2 ESBLs鑒定結果 產ESBLs酶表型篩選試驗初步篩出55株（77.46%），可疑產ESBLs菌株。通過進一步確認試驗在58株疑產ESBLs菌株中共檢出產ESBLs菌35株（49.30%）。

2.3 大腸埃希菌中整合子遺傳標記基因的PCR法檢測情況

2.3.1 整合子遺傳標記在不同耐藥模式中檢出結果見表1。

表1 各種耐藥模式中整合子遺傳標記基因陽性率比較

2.3.2 整合子遺傳標志在產ESBLs酶菌株中檢出結果 見表2。

表2 產ESBLs酶大腸埃希菌不同耐藥模式中整合子遺傳標記檢出情況

2.3.3 整合子遺傳標記在非產ESBLs酶大腸埃希菌中檢出結果 見表3。

表3 非產ESBLs酶菌株不同耐藥模式中整合子遺傳標記基因陽性率的比較

2.4 整合子遺傳標記qacE△sul1電泳圖片和基因測序結果

將本實驗中Ⅰ類整合子遺傳標記（qacE△sul1）PCR擴增產物序列測序后的基因在BLAST上進行比對發(fā)現(xiàn)與基因庫中已登陸的基因相同，整合子遺傳標記qacE△sul1電泳圖見圖1。

圖1 整合子遺傳標記qacE△sul1電泳圖

3 討 論

本研究中菌株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、鏈霉素耐藥情況嚴重，尤其是在多耐藥模式中更為突出，以CTX＋LVE／CIP＋S模式常見。但對頭孢西丁和阿米卡星仍有較高的敏感性，這與頭孢西丁對β－內酰胺酶高度穩(wěn)定，阿米卡星對氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定的抗菌作用特點有關。

大腸埃希菌產ESBLs在不同國家的檢出有明顯差異，如土耳其大腸埃希菌的ESBLs發(fā)生率僅為12%［3］；而國內近5年大腸埃希菌產ESBLs菌株檢出率從46.0% 上升至63.4%，呈逐年增高的趨勢［5］。CTX－M（以高度水解頭孢噻肟為特征已dn為國內外流行最廣的ESBLs［6］）。本研究中大腸埃希菌ESBLs檢出率為49.30%（36株），與文獻所報道基本一致。

基因盒－整合子系統(tǒng)多見于革蘭陰性桿菌，以腸桿菌、銅綠假單胞菌為主，是細菌尤其是革蘭陰性菌多重耐藥快速發(fā)展的重要原因［7］。依據(jù)整合酶基因序列的不同，將整合子分為6類，亦有文獻報道為8類［8］，目前報道較多的僅有4類。Ⅰ～Ⅲ類整合子已被證明與細菌耐藥性有關，為耐藥整合子，其中第Ⅰ、Ⅱ類整合子是最常見捕獲和表達耐藥基因的整合子［9］。近年來，國外大量文獻報道整合子可介導病原體各種藥基因獲得整合子病原菌可表現(xiàn)為多藥耐藥［10－13］。QacE△1－sul1是Ⅰ類整合子的遺傳標記，實質是qacE△1基因和sul1基因組成的重疊基因，位于Ⅰ類整合子3′保守區(qū)。Dahmen等［14］研究提示:6種不同腸桿菌中I類整合子基因具有較高的檢出率，整合子遺傳標記以sul1常見，sul1和sul2的重疊顯現(xiàn)明顯。有學者對血培養(yǎng)中的大腸埃希菌進行研究發(fā)現(xiàn)，幾乎有一半菌株中整合子及Sul基因陽性，其中以經典類整合子qacE△1－sul1最多。

本研究結果提示，Ⅰ類整合子在大腸埃希菌中有高的檢出率（78.57%），與文獻報道相近。實驗結果提示:大腸埃希菌產ESBLs酶且整合子陽性者，出現(xiàn)耐藥概率比單純攜帶整合子或者產ESBLs酶的菌株要大，尤其在多耐藥模式中更為明顯。

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