陳衛(wèi)群，孔德勇，王 卉，劉水逸，孔慶志，盧忠心△

（武漢市中心醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.中心實(shí)驗(yàn)室 430014）

microRNA（miRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個(gè)核苷酸非編碼小分子RNA，通過靶mRNA降解或抑制其翻譯來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝，以及腫瘤、病毒感染等多種疾病中都具有重要的作用。研究表明，miRNA作為癌基因或抑癌基因，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程；不同腫瘤組織miRNA表達(dá)譜不同。最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中存在腫瘤細(xì)胞特異性miRNA，并且高度穩(wěn)定，表明腫瘤患者血清中miRNA的表達(dá)可能成為新的腫瘤標(biāo)志物。本研究通過檢測淋巴瘤患者外周血中循環(huán)miR－21的表達(dá)，為淋巴瘤的早期診斷提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集60例臨床確診的淋巴瘤患者外周血，50名健康體檢人群外周血作為正常對照組。選擇臨床確診的淋巴瘤患者30例，同時(shí)收集腫瘤活檢組織和外周血。腫瘤組織和血清中miRNA的提取采用miRNA提取試劑盒（mirVanaTMmiRNA Isolation Kit，美國 Ambion公司），microRNA－21（miR－21）檢測采用TaqMan miRNA分析試劑盒（美國ABI公司）。

1.2 方法 采用FQ－PCR檢測miR－21的表達(dá)水平，用miRNA提取試劑盒提取腫瘤組織和血清中的miRNA，用miR－21檢測試劑盒檢測miR－21的表達(dá)水平。首先取10ng總RNA與3μL逆轉(zhuǎn)錄酶混合，在15μL反應(yīng)體系中，16℃30min、42℃30min、85℃5min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；然后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 150倍稀釋，取2μL稀釋的cDNA與2μL TaqMan引物混合，在20μL反應(yīng)體系中，95℃10min變性，隨后95℃15s，60℃60s，40個(gè)循環(huán)。相對miRNA表達(dá)水平用2△△Ct計(jì)算改變倍數(shù)，U6snRNA作為內(nèi)對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示。各指標(biāo)間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者外周血中循環(huán)miR－21的表達(dá)結(jié)果 與正常對照組比較，淋巴瘤患者外周血中循環(huán)miR－21顯著升高（t＝6.9，P＜0.0001），結(jié)果見圖1。

2.2 淋巴瘤患者外周血循環(huán)中miR－21與對應(yīng)腫瘤組織中的miR－21的相關(guān)性分析結(jié)果 結(jié)果顯示淋巴瘤患者外周血中循環(huán)miR－21的表達(dá)與對應(yīng)腫瘤組織中mir－21的表達(dá)顯著相關(guān)（r2＝0.931，P＜0.0001），見圖2。

圖1 兩組患者血清中miR－21的表達(dá)

圖2 淋巴瘤患者外周血中循環(huán)miR－21的表達(dá)與對應(yīng)腫瘤組織中miR－21的表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個(gè)核苷酸非編碼小分子RNA，通過降解靶mRNA或抑制其翻譯來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝，以及腫瘤、病毒感染等多種疾病中都具有重要的作用，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和前沿之一［1－2］。目前已發(fā)現(xiàn)700多種人類miRNA，由于miRNA通過與靶序列的不完全互補(bǔ)來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，同時(shí)一個(gè)基因可以被多個(gè)miRNA所調(diào)節(jié)，所以miRNA被認(rèn)為是最重要的調(diào)節(jié)分子之一，大約92%的人類基因被miRNA所調(diào)節(jié)［3］。目前國外對miRNA的研究進(jìn)展很快，隨著對miRNA的產(chǎn)生機(jī)制、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子機(jī)制研究不斷深入，miRNA的檢測方法的不斷完善，miRNA作為診斷的分子標(biāo)志和治療及預(yù)后判斷的分子靶點(diǎn)也進(jìn)入臨床前研究。國內(nèi)目前主要集中于對單個(gè)疾病的miRNA表達(dá)譜的研究，機(jī)制研究很少，檢測方法不夠成熟并且比較單一。

miRNA與腫瘤密切相關(guān)，約52%的miRNA編碼基因位于腫瘤相關(guān)基因位點(diǎn)和脆性染色體區(qū)域［4］；在腫瘤中miRNA異常表達(dá)且具有組織特異性，不同腫瘤組織miRNA表達(dá)譜不同［5］；進(jìn)一步研究表明miRNA作為癌基因或抑癌基因，廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［6］。miRNA可能成為腫瘤診斷的新的分子標(biāo)志物和治療及預(yù)后判斷的分子靶點(diǎn)，由于miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，因此更有利于腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，必將具有廣泛的臨床應(yīng)用前景［7］。

最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中存在腫瘤細(xì)胞特異性miRNA，并且高度穩(wěn)定，能夠抵抗血清中以及外源性RNase［8－10］。由于血清標(biāo)本易于獲得且容易被患者所接受，檢測腫瘤患者血清中miRNA的表達(dá)，將成為腫瘤診斷、治療以及預(yù)后判斷的有利工具。但至目前為止進(jìn)行腫瘤患者血清中miRNA表達(dá)檢測研究的病例數(shù)非常有限，并且尚未見應(yīng)用腫瘤患者血清中miRNA的表達(dá)進(jìn)行腫瘤分級分期和預(yù)后判斷的研究。因此擴(kuò)大病例數(shù)并利用進(jìn)行腫瘤患者血清中miRNA的表達(dá)進(jìn)行腫瘤分級分期和預(yù)后判斷的研究將具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

miR－21是目前發(fā)現(xiàn)的惟一在多種實(shí)體腫瘤（肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部腫瘤、食管癌等）及非實(shí)體瘤（慢性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞性淋巴瘤等）中高表達(dá)的miRNA［11－13］，也是第一個(gè)在腫瘤患者血清中檢測到的miRNA。作者的前期研究表明，miR－21通過靶向細(xì)胞凋亡相關(guān)基因（programmed cell death 4，PDCD4）而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展；應(yīng)用反義 miR－21（anti－miR－21）抑制miR－21的表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［14］，被認(rèn)為是重要的癌基因之一。

淋巴瘤是原發(fā)于淋巴結(jié)或淋巴結(jié)外組織或器官的一種惡性腫瘤，根據(jù)臨床和病理特點(diǎn)不同，淋巴瘤分為霍奇金病（hodgkin disease，HD）和非霍奇金淋巴瘤（non－h(huán)odgkin lymphoma，NHL）。淋巴瘤的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、病理學(xué)檢查及必要的輔助性檢查，對只有深部病變而無淺表淋巴結(jié)腫大者，診斷往往較困難。近年來淋巴瘤發(fā)病率呈不斷增加趨勢，尋找有效地、無創(chuàng)或微創(chuàng)的早期診斷標(biāo)志對于淋巴瘤的防治具有重要意義。研究表明淋巴瘤腫瘤組織中miR－21高表達(dá)［15］，表明miR－21可能成為淋巴瘤早期診斷的重要標(biāo)志之一。作者的研究結(jié)果顯示，在淋巴瘤患者外周血中循環(huán)miR－21表達(dá)水平高于正常對照組水平，且與淋巴瘤患者腫瘤組織中miR－21的表達(dá)密切相關(guān)，循環(huán)miR－21的檢測可能成為淋巴瘤新的早期診斷的分子標(biāo)志。血清miR－21作為淋巴瘤診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物不僅具有創(chuàng)傷小，方法準(zhǔn)確、便捷的優(yōu)勢，而且還可改進(jìn)淋巴瘤診斷、分類、預(yù)后估計(jì)、療效及復(fù)發(fā)預(yù)測的精度。但是，由于miR－21在多種腫瘤中高表達(dá)，僅僅檢測血清miR－21作為腫瘤標(biāo)志物特異性不足，若將多種miRNA組合使用并與其他類型腫瘤標(biāo)志物檢測相結(jié)合，可望顯著提高診斷的準(zhǔn)確性。血清miRNA作為新興的腫瘤分子標(biāo)志物在未來的腫瘤臨床診斷和治療中會有更好的應(yīng)用前景。

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