侯殿龍 鞏同玉 耿濤

缺血性腦血管疾病在臨床上發(fā)病率、致殘率高，是我國臨床患者主要的病死原因之一。凋亡是腦缺血后神經元死亡的重要方式，目前認為細胞凋亡受Bcl-2、Bax等多種凋亡相關基因的調控。而銀杏達莫能減輕神經細胞凋亡，但機制尚不完全清楚。本實驗研究銀杏達莫對大鼠局灶性腦缺血后神經細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 材料選用鼠齡3個月左右，體重270～300 g的健康雄性Wistar大鼠20只(由山東大學醫(yī)學院動物實驗中心提供)，隨機分為缺血對照組、缺血6 h組，每組10只動物。缺血后6 h組于術后20 min經腹腔注射銀杏達莫(山西普德藥業(yè)股份有限公司)0.4 ml/kg;對照組腹腔注射生理鹽水，注射總量皆為0.4 ml/kg。皆于術后6 h斷頭取腦。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備大鼠大腦中動脈缺血模型參考改良Nagasawa法。

1.2.2 切片的制備實驗動物在缺血6 h后以多聚甲醛經心臟灌注固定，斷頭取腦，再以多聚甲醛固定24 h。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，視交叉平面冠狀切開制成2 mm厚的組織塊。

1.2.3 ①常規(guī)HE染色病理檢查。②Bcl-2和bax免疫組化染色Bcl-2及Bax試劑盒購于武漢博士德公司，具體操作按說明書進行。

1.2.4 OLYMPUS光學顯微鏡觀察切片每只動物測3張切片，分別觀測Bcl-2、Bax陽染數目。陽性反應物部位呈棕黃色，細胞核呈淡藍色。不重復選取10個高倍視野，計數每個視野內陽性染色細胞數，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行數據處理。組間比較采用t檢驗，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

Bcl-2、Bax陽性細胞胞漿呈棕黃色，均勻彌漫染色，大鼠大腦中動脈閉塞后銀杏達莫治療組較缺血對照組缺血壞死區(qū)周邊腦組織Bcl-2的含量有明顯增加，而Bax的含量則明顯減少。

3 討論

凋亡是腦缺血后神經元死亡的重要方式，尤其是遲發(fā)性神經元死亡［1］。Li Y等［2］提示較長時間的腦缺血，凋亡主要發(fā)生在梗死周邊區(qū)的內緣即所謂的“半暗帶”。原癌基因B細胞淋巴瘤-2(Bc1-2)基因家族中Bcl-2和Bax基因是反映細胞凋亡但作用相反的一組重要調控基因，Bcl-2以細胞器膜(如線粒體、內質網和核膜)的整和膜蛋白形式存在，Bcl-2抑制細胞凋亡，具有明顯的抗神經細胞凋亡作用，可保護神經細胞;而Bax則以非活性的形式分布于胞漿中或細胞骨架上，Bax促進細胞凋亡［3］。

表1 大鼠大腦中動脈閉塞后腦組織表達Bcl-2、Bax的改變(±s%)

表1 大鼠大腦中動脈閉塞后腦組織表達Bcl-2、Bax的改變(±s%)

注：與缺血對照組比較，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義

Bcl-2 Bax缺血對照組 10 97.3±4.4 82.5±6.6缺血6 h組分組 例數10 77.2±2.1 95.4±4.9

銀杏達莫注射液為銀杏葉提取物并在此基礎上加入雙嘧達莫的復合制劑，其主要有效成分為：銀杏黃酮甙24%、銀杏苦內酯3.1%、白果內酯2.9%、雙密達莫10%，銀杏黃酮甙和萜內酯。Unal等［4］發(fā)現(xiàn)長期給予銀杏達莫可以增加大鼠局灶性腦缺血后Bcl-2的基因表達。Jelie［5］等實驗表明銀杏達莫能上調PC12細胞的Bcl-2表達、抑制caspase-3激活、下凋caspase-12、減少細胞色素C釋放和DNA斷裂，減少細胞凋亡發(fā)生。本研究顯示銀杏達莫能升高大鼠局灶性腦缺血后Bcl-2表達，降低bax表達，Bcl-2/Bax比值升高，減少細胞凋亡發(fā)生，對腦缺血起保護作用。其可能的機制：①在血液學方面有改善微循環(huán)作用，增加紅細胞變形能力，拮抗血小板活化因子，抑制血小板活化與聚集，降低血液黏滯度，抗血栓形成。②在能量代謝方面有保護線粒體的功能，減少酸中毒，清除氧自由基，防止自由基對神經細胞的損傷，抑制自由基誘導的神經細胞壞死和凋亡。③通過對抗興奮性氨基酸的毒性作用，減輕腦水腫，減少腦梗死的面積。④刺激前列環(huán)素和內皮舒張因子，抑制細胞內鈣超載。

本研究認為，銀杏達莫具有減少細胞凋亡，對腦缺血起保護作用，是治療急性腦梗死、挽救缺血半暗帶有效的藥物。

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