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氨基酸對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常代謝都有重要的作用，而且蛋白質(zhì)是動(dòng)物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是評(píng)價(jià)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的一個(gè)指標(biāo)，而氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，所以氨基酸的種類和含量也就是評(píng)價(jià)飼料質(zhì)量的根本依據(jù)，從而準(zhǔn)確檢測(cè)氨基酸的含量和種類具有重要意義。柱后衍生的方法，雖然準(zhǔn)確性高，但是耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，所以本文采用柱前衍生的方法以縮短分析時(shí)間，增加靈敏度。同時(shí)該方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存數(shù)月，克服了柱前衍生法衍生物不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，另外該方法準(zhǔn)確性高，用標(biāo)準(zhǔn)品做未知樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的含量與標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示值非常接近。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

飼料樣品1與樣品2為市售兩種不同品牌的飼料；Venusil AA氨基酸分析方法包(含衍生試劑PITC、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、Venusil AA氨基酸分析專用柱4.6 mm×250 mm，5 μm)購(gòu)自天津博納艾杰爾科技有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司)；水(屈臣氏4 L純凈水)、乙腈(色譜純，霍尼韋爾)；Agilent 1100高效液相色譜儀(包括紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和高壓輸液泵)。

1.2 樣品前處理

酸水解法：準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，使樣品氨基酸總量在50～75mg范圍內(nèi)，置于20～30 ml安瓿瓶中，加入10 ml含0.1%苯酚的6 mol/l鹽酸，振搖使樣品溶解或者是樣品均勻分散在溶液中，將安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷凍3～5 min，充氮后用噴燈熔封，然后置于(110±1)℃烘箱中水解24 h，取出冷卻，取水溶液1 ml，置于濃縮管中用濃縮儀濃縮至干，加入1 ml的0.1 mol/l稀鹽酸溶解，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，取上清液貯存于冰箱中，供衍生使用。

1.3 衍生方法

準(zhǔn)確量取水解后溶液及氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品200 μl，分別置于1.5 ml離心管中，往每只離心管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)50 μl，然后分別加入三乙胺乙腈溶液100 μl和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，搖勻室溫靜置衍生1 h。衍生結(jié)束后分別加入400 μl正己烷，振搖并靜置10 min，取下層溶液200 μl并用水稀釋到1 ml，混合均勻后用0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾即可。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 溶液配制

流動(dòng)相A：稱取15.2 g無(wú)水乙酸鈉,加水1 850 ml，溶解后用冰醋酸調(diào)pH值到6.5,然后加乙腈溶液140 ml,混合均勻并用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

流動(dòng)相B：80%乙腈水溶液。

1.4.2 高效液相檢測(cè)條件

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀；

色譜柱：Venusil AA氨基酸分析專用柱4.6 mm×250 mm，5 μm，100 A；

流速：1 ml/min；

進(jìn)樣量：10 μl；

檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；

柱溫：40℃；

檢測(cè)梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度變化

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 液相條件的建立

樣品中氨基酸含量比較低，而且直接檢測(cè)溶劑效應(yīng)較大，經(jīng)過(guò)衍生后直接檢測(cè)樣品中的氨基酸不能完全分離，本文通過(guò)用水稀釋衍生溶液的方法降低檢測(cè)中的溶劑效應(yīng)，并且經(jīng)過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相梯度使18種氨基酸得到良好的分離。

但是實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中相同的檢測(cè)條件下，儀器不同，分離效果差別較大，有的甚至都完全分不開(kāi)，為此本文還開(kāi)發(fā)了一種基礎(chǔ)檢測(cè)條件，可以根據(jù)儀器的自身特點(diǎn)，稍加調(diào)整流動(dòng)相的比例即可使18種氨基酸得到較好的分離?；A(chǔ)檢測(cè)條件如表2所示。

表2 流動(dòng)相基礎(chǔ)梯度變化

2.2 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性、線性及準(zhǔn)確性

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品按照1.3節(jié)方法衍生后，相同的條件（1.4.2節(jié)）下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可知該方法比較穩(wěn)定，可以用來(lái)檢測(cè)氨基酸樣品，其實(shí)驗(yàn)圖譜如圖1所示。

表3 氨基酸的線性回歸方程、標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限

根據(jù)儀器對(duì)各個(gè)物質(zhì)的響應(yīng)情況，將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成2.5 μmol/ml(胱氨酸為1.25 μmol/ml)、1.25 μmol/ml（胱氨酸為 0.625 μmol/ml）、0.5 μmol/ml（胱氨酸為 0.25 μmol/ml）、0.25 μmol/ml(胱氨酸為0.125 μmol/ml)、0.125 μmol/ml(胱氨酸為0.0625 μmol/ml)5個(gè)濃度，然后按照1.3節(jié)的衍生方法同時(shí)衍生處理，樣品經(jīng)稀釋過(guò)濾后在相同的實(shí)驗(yàn)條件下（1.4.2節(jié)）進(jìn)樣，依據(jù)進(jìn)樣濃度X（μmol/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，根據(jù)各個(gè)物質(zhì)峰高、噪音，遵循S/N=3計(jì)算出最低檢出限，回歸方程及檢出限見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，在選定的液相色譜條件下氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)偏差試驗(yàn)色譜

為了驗(yàn)證建立方法的準(zhǔn)確性，本文用Sigma氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，以博納艾杰爾科技的標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)相同的方法（1.3節(jié)）衍生后，按照相同的條件（1.4.2節(jié)）檢測(cè)得出檢測(cè)值與標(biāo)示值之間的偏差，除胱氨酸外，偏差均小于3%，接近標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示值，證明該方法準(zhǔn)確性高，檢測(cè)效果穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4 檢測(cè)Sigma標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)誤差

因?yàn)榘腚装彼嵩趬A性環(huán)境下能夠轉(zhuǎn)化成胱氨酸，所以經(jīng)堿水解后胱氨酸的含量不穩(wěn)定，此外有時(shí)兩個(gè)半胱氨酸殘基會(huì)發(fā)生二硫鍵交聯(lián)，經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不穩(wěn)定，非常容易分解，所以胱氨酸的相關(guān)系數(shù)和偏差都比較大。

2.3 樣品檢測(cè)結(jié)果

按照上述方法檢測(cè)處理后的飼料樣品可得色譜圖如圖2、圖3，通過(guò)單點(diǎn)校正法可以得出樣品1和樣品2中含有標(biāo)準(zhǔn)品中的17種氨基酸。

樣品中的17種氨基酸均能得到良好的分離，這說(shuō)明在有基質(zhì)干擾的情況下本文建立的這種方法同樣適用，而且樣品連續(xù)進(jìn)樣重復(fù)性非常好，未出現(xiàn)樣品變質(zhì)或者峰型變差的現(xiàn)象，證明本文建立的方法在有基質(zhì)干擾的情況下也同樣克服了衍生氨基酸容易分解的問(wèn)題。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

按照上述實(shí)驗(yàn)條件，可以準(zhǔn)確檢測(cè)飼料樣品中17種氨基酸，同時(shí)檢測(cè)的靈敏度及線性都能滿足檢測(cè)的要求，而且本方法準(zhǔn)確性高，與樣品中含有氨基酸的真值偏差非常小，所以該方法可以準(zhǔn)確的檢測(cè)飼料樣品中的氨基酸。

圖2 實(shí)際樣品1色譜

圖3 實(shí)際樣品2色譜

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