游飛明

（1.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建福州350002；2.國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（福州），福建福州350002）

飼料用香味劑是通過利用畜禽嗅覺、味覺等生理學(xué)原理，用來改善和增強(qiáng)飼料天然口味與氣味，增強(qiáng)動(dòng)物食欲，提高動(dòng)物采食量，促進(jìn)飼料消化吸收與利用，而添加于飼料中的特殊添加物，其在飼料配方中一直占有舉足輕重的位置。香味劑成分主要來源于植物的根、莖、葉、果及其提取濃縮料和人工化合物[1-2]。乳酸乙酯、乙基麥芽酚及乙基香蘭素等在飼料中作為香味劑成分已得到廣泛使用。乳酸乙酯是香味劑中最常用的香基成分，特別適用于豬仔的香味劑[3]；乙基麥芽酚本身具有特有焦香氣，又能對(duì)某一個(gè)成分的香味起增效作用，因此，是飼料香味劑不可或缺的成分；乙基香蘭素具有強(qiáng)烈香莢蘭豆香氣，香氣強(qiáng)度是香蘭素3～4.5倍，具有增香和定香作用，也是飼料香味劑常用的成分[4]。近幾年研發(fā)生產(chǎn)的飼料香味劑中通常含有這三種物質(zhì)中一種或全部。

目前，我國飼料添加劑產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)還不完善，大多數(shù)飼料添加劑產(chǎn)品尚無國家或行業(yè)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，如飼料香味劑中乳酸乙酯、乙基麥芽酚及乙基香蘭素沒有相關(guān)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道也較少。這些組分檢測(cè)方法有紫外分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，研究的對(duì)象以食品為主[5-13]，采用氣相色譜法同時(shí)檢測(cè)飼料香味劑中乳酸乙酯、乙基麥芽酚及乙基香蘭素研究工作未見報(bào)導(dǎo)。本研究通過檢測(cè)條件摸索優(yōu)化和樣品前處理方法摸索篩選，建立飼料香味劑中香味成分乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素含量檢測(cè)方法。該方法的建立為制訂國家或行業(yè)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，對(duì)規(guī)范飼料添加劑生產(chǎn)、提高飼料添加劑產(chǎn)品質(zhì)量、營造公平的飼料添加劑市場競爭環(huán)境都具有十分重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC-2010（配火焰離子化檢測(cè)器、AOC-20i自動(dòng)進(jìn)樣器、GC solution工作站）氣相色譜儀（日本島津公司）；色譜柱 ZB-WAXplus，30 m×0.32 mm×0.25 μm(美國菲羅門公司)；XW-80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；丙酮，分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乳酸乙酯：純度＞99.0%（Fluka）；乙基麥芽酚：純度＞99%（Sigma）；乙基香蘭素：純度＞97.3%（Chroma DEX）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別稱取0.25 g(精確到0.000 1 g)乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素參考物質(zhì)于25 ml容量瓶中，以丙酮溶解并定容，則該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素濃度均為10.0mg/ml，于4℃冰箱保存。

1.3 樣品溶液制備

稱取試樣1 g（精確到0.000 1 g）于25 ml容量瓶中，加入丙酮15 ml，渦旋混合1 min，用丙酮定容，充分搖勻，靜置5 h，取上清液過0.45 μm的微孔濾膜，供上機(jī)測(cè)定。

1.4 色譜條件

柱溫箱溫度：65℃ 保持4 min，以30℃/min上升到 245℃ 保持5 min；氣化室溫度：250℃；檢測(cè)器溫度：280℃；載氣：氮?dú)猓兌取?9.999%），初始柱流量：3.0 ml/min，尾吹氣流量：30 ml/min，進(jìn)樣量：1 μl，分流比：30∶1。

2 結(jié)果

2.1 方法的線性范圍

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度為0.02、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次從低濃度到高濃度進(jìn)樣，每一濃度進(jìn)樣兩針，按其所得峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 3種飼料香味劑的回歸參數(shù)

2.2 方法的精密度

2.2.1 儀器的精密度

取濃度為2.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液按選定的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，得乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素的峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.8%、1.0%、1.1%，說明儀器重復(fù)性滿足要求。

2.2.2 方法的精密度

選取含有乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素的香味劑樣品，按1.3規(guī)定樣品溶液制備方法和1.4節(jié)規(guī)定的色譜條件進(jìn)行6次平行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表2）表明方法精密度高。

表2 方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 方法的回收率

為了考察方法的準(zhǔn)確度，在已知含量的樣品基質(zhì)中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分3個(gè)水平，每個(gè)水平平行測(cè)定4次，依添加前后測(cè)定值的差值與實(shí)際添加量的百分比分別計(jì)算回收率，結(jié)果（見表3）表明方法回收率高。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=4)

2.4 提取率考察

基于香味劑中香味成分易于揮發(fā)，含量隨儲(chǔ)存時(shí)間增長而降低，本實(shí)驗(yàn)選擇含量較為穩(wěn)定的組分乙基香蘭素的含量為表征對(duì)象考察提取率。取理論添加量為80 g/kg的香味劑進(jìn)行提取測(cè)定，結(jié)果為74.4 g/kg，提取率為93.0%，提取率較高，能滿足要求。

2.5 穩(wěn)定性考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性

將濃度為3mg/ml標(biāo)準(zhǔn)混合液在4℃冰箱中放置3個(gè)月后，與新配制的濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)進(jìn)樣分析，以新配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照測(cè)定放置3個(gè)月后的舊標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值，計(jì)算測(cè)定平均值與配制時(shí)理論值的相對(duì)偏差。測(cè)定結(jié)果（見表4）表明標(biāo)準(zhǔn)混合液在4℃冰箱中放置3個(gè)月濃度值基本保持不變，標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定有效。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性

2.5.2 樣品溶液穩(wěn)定性

樣品按1.3規(guī)定的方法制備后，分別取靜置2、5、24、48 h的上清液進(jìn)樣分析，結(jié)果（見表5）表明樣品溶液中組分含量靜置5 h達(dá)到平衡，靜置5～24 h保持穩(wěn)定，靜置48 h乙基麥芽酚含量有所下降。所以，樣液上機(jī)分析最佳時(shí)間為靜置5～24 h。

表5 樣品溶液穩(wěn)定性(g/kg)

2.6 樣品測(cè)定

收集不同香味劑樣品，按本文建立的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表6。4個(gè)樣品測(cè)定結(jié)果均達(dá)到規(guī)定限值，有1個(gè)樣品檢出乙基麥芽酚，但標(biāo)簽未標(biāo)示。因此，盡快建立飼料香味劑含量檢測(cè)方法，發(fā)布相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，有助于規(guī)范飼料調(diào)味劑生產(chǎn)，為科學(xué)、安全飼養(yǎng)畜禽提供依據(jù)。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果(g/kg)

3 討論

3.1 檢測(cè)條件優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的選擇

色譜柱固定相類型是影響組分分離效果的重要因素。本研究綜合考慮組分極性和化學(xué)結(jié)構(gòu),參考文獻(xiàn)[9-11],選擇極性柱ZB-WAXplus(30 m×0.32 mm×0.25 μm)和弱極性柱ZB-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，結(jié)果乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素在ZB-5柱上出峰時(shí)間較長，組分間出峰間隔較長，要縮短分析時(shí)間需要更高的升溫速率，造成基線漂移較大。綜合考慮峰形、靈敏度、分析時(shí)間，基線漂移等因素，選用ZB-WAXplus(30 m×0.32 mm×0.25 μm)色譜柱。

3.1.2 柱溫和柱流量的優(yōu)化選擇

除了色譜柱，柱溫和柱流量也是影響組分分離效果的主要因素?；谌樗嵋阴ァ⒁一溠糠?、乙基香蘭素沸點(diǎn)差異較大，同時(shí)考慮溶劑聚焦、靈敏度等因素，本研究反復(fù)實(shí)驗(yàn)比較了不同的初始溫度、升溫速率、柱流量后,確定升溫程序?yàn)?初始溫度為65℃,保持4 min,以30℃/min上升到245℃，保持5 min，初始柱流量為3 ml/min。

在選定的色譜條件下，組分峰形對(duì)稱尖銳，分離效果好，分析時(shí)間合理。標(biāo)樣色譜圖和樣品色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)樣和樣品色譜

3.2 樣品前處理方法摸索篩選

飼料香味劑大致有液體型和固體型兩類，固體型又有吸附型和噴霧干燥型兩種。固體吸附型香味劑由具有一定吸附性的載體和香味成分通過加工制備而成，載體含量通常達(dá)到80%以上[14-15]。由于載體對(duì)香味成分具有一定的吸附性，如何將香味成分充分、有效地從載體中提取出來成為本研究技術(shù)核心。目前市面上香味劑以固體吸附型為主，因此本研究以固體吸附型香味劑為研究對(duì)象。

3.2.1 提取溶劑的選擇

乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素均能溶于乙醇，參考前人經(jīng)驗(yàn)[9-11]，選擇無水乙醇為提取溶劑。但在考察樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樣品溶液中乳酸乙酯和乙基麥芽酚含量隨著放置時(shí)間延長不斷提高，直到24 h才基本穩(wěn)定，而乙基香蘭素含量基本穩(wěn)定不變（結(jié)果見圖2），說明用無水乙醇很難在短時(shí)間內(nèi)將乳酸乙酯和乙基麥芽酚從載體中充分提取出來。

圖2 放置時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響

丙酮、三氯甲烷對(duì)目標(biāo)組分均有較好溶解性，且對(duì)基質(zhì)有較好的滲透力。在同等條件下比較丙酮、三氯甲烷和無水乙醇對(duì)目標(biāo)組分的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙酮提取效果最好，無水乙醇次之，三氯甲烷最差，具體數(shù)據(jù)見表7，因此選擇丙酮做為提取溶劑。

表7 不同溶劑提取結(jié)果(g/kg)

3.2.2 提取方法選擇

提取方法通常對(duì)提取效率有較大影響。試驗(yàn)比較采用渦旋混合1 min，震蕩提取5 min，超聲提取5 min和超聲提取30 min，靜置2 h，取上清液進(jìn)樣，結(jié)果不同提取方法組分含量無明顯差異。選擇渦旋混合1 min做為樣品提取方法。

3.3 干擾試驗(yàn)

飼料香味劑香味成分較多，如果樣品中共存的香味成分多可能會(huì)互相干擾，為了考察另外幾種常用香味成分是否對(duì)本方法干擾，在標(biāo)樣中加入濃度相近的乳酸丁酯、麥芽酚、甲基環(huán)戊烯醇酮，按1.4節(jié)規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析，分離結(jié)果見圖3。從分離結(jié)果和峰面積判斷，這些組分對(duì)乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素定性和定量均無干擾。

圖3 添加了其他香味成分的色譜

3.4 定量方法選擇

外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法是色譜分析中最常用的定量方法，內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果受儀器條件和進(jìn)樣量等因素影響較小，然而內(nèi)標(biāo)物的選擇較難，需要保證樣品基質(zhì)在內(nèi)標(biāo)處沒有干擾峰。外標(biāo)法樣品制備過程簡單，但是定量結(jié)果受儀器條件和進(jìn)樣量等因素影響較大，現(xiàn)在多數(shù)儀器配置自動(dòng)進(jìn)樣器，載氣流量用電子流量閥控制，儀器條件和進(jìn)樣量重現(xiàn)性較好，克服了外標(biāo)法定量的缺點(diǎn)。為了考察定量方法是否對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，同一樣品分別用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法（甲基環(huán)戊烯醇酮為內(nèi)標(biāo)）重復(fù)測(cè)定4次，取平均值比較，結(jié)果（見表8）無明顯差異，故本研究選擇外標(biāo)法定量。

4 結(jié)論

本研究建立的氣相色譜法測(cè)定飼料香味劑中香味成分乳酸乙酯、乙基麥芽酚、乙基香蘭素含量方法，具有樣品前處理操作簡單，提取效果高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，方法線性范圍寬，線性關(guān)系好，加標(biāo)回收率高，重現(xiàn)性好；使用儀器設(shè)備普及率高，可在飼料添加劑質(zhì)量檢測(cè)中加以推廣應(yīng)用。該方法為正在制訂的福建省地方標(biāo)準(zhǔn)《飼料調(diào)味劑中六種香料成分含量的測(cè)定-氣相色譜法》提供技術(shù)研究基礎(chǔ)。

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