（北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206）

硝基呋喃類藥物（Nitrofurans）是一類人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，主要包括呋喃唑酮（furazolidone）、呋喃西林(nitrofurazone)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、呋喃它酮(furaltadone)，主要用于敏感菌所致的細(xì)菌性痢疾、腸炎、球蟲(chóng)病的預(yù)防和治療。硝基呋喃類藥物具有較強(qiáng)的致癌、致突變、致畸等副作用，嚴(yán)重危害人體健康，歐盟和日本均已禁止在食品中使用硝基呋喃類藥物，我國(guó)也規(guī)定在飼料生產(chǎn)中全面禁用[1-3]。

目前硝基呋喃類藥物殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[4-5]，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[6]、液相色譜-紫外法[7-8]、酶聯(lián)免疫法[9-10]等，上述檢測(cè)方法操作繁瑣，成本高，并且需要由受過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的技術(shù)人員來(lái)完成，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。試紙檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)所需時(shí)間短，攜帶方便，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯金酸、檸檬酸三鈉、甲醇等化學(xué)試劑均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、牛血清白蛋白、卵清蛋白購(gòu)自sigma公司。

1.2 儀器

磁力加熱攪拌器（常州國(guó)華生產(chǎn)），數(shù)控切條機(jī)CT300（上海金標(biāo)生產(chǎn)）、連續(xù)式劃膜儀HM8000（上海金標(biāo)生產(chǎn)），其余均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物

8周齡的雌性Balb/C小鼠。

1.3.2 硝基呋喃類藥物半抗原合成

取2-醛基-5-硝基呋喃1.41 g與氨基丁酸2.0 g溶入150 ml甲醇中，加入10 ml三乙胺，室溫下反應(yīng)10～20 h，稀鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，蒸除溶劑后，柱層析得到硝基呋喃類藥物半抗原。

1.3.3 硝基呋喃類藥物免疫抗原和包被抗原的合成

1.3.3.1 免疫抗原合成

取上述步驟得到的硝基呋喃類藥物半抗原18mg，溶解于1.5 ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中；取36mg碳化二亞胺（EDC）用0.2 ml水充分溶解后，加入上述DMF中，室溫下攪拌24 h，得到Ⅰ液；稱取OVA60mg，使之充分溶解在5.3 ml PBS(pH值7.2)中，得到Ⅱ液；將上述得到的Ⅰ液逐滴緩慢滴加到Ⅱ液中，并于室溫下攪拌24 h；用0.01 mol/l PBS，4℃透析3 d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 包被抗原合成

取上述步驟得到的硝基呋喃類藥物半抗原25mg，溶解于1.5 ml DMF中，取50mg EDC用0.2 ml去離子水充分溶解后，加入上述DMF中，室溫下攪拌24 h，即可得到Ⅲ液；稱取BSA 60mg，使之充分溶解在4.3 ml PBS（pH值7.2）中，得到Ⅳ液；將Ⅲ液逐滴緩慢滴加到Ⅳ液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/l PBS 4℃透析3 d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 生產(chǎn)硝基呋喃類藥物單克隆抗體的制備

用150 μg的硝基呋喃類藥物免疫抗原與等量FCA混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射。二免和三免時(shí)，將FCA換成FIA劑量和方法同上，每次免疫間隔時(shí)間為2周，三免后第7 d，小鼠尾部靜脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃過(guò)夜，12 000 r/min離心10 min，收集血清，4℃保存，用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)，待效價(jià)較高時(shí)，按照150 μg/只的劑量腹腔注射加強(qiáng)免疫。3 d后取小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，以有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆，并按照常規(guī)方法制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化。用SDS-PAGE法進(jìn)行純化后的硝基呋喃類藥物單克隆抗體電泳檢測(cè),濃縮膠濃度為5 g/100 ml，分離膠濃度為10 g/100 ml，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 抗體電脈鑒定

純化的單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE顯示，在變性解鏈狀態(tài)下有兩條帶，一條為輕鏈，位于24.5 kD處；一條為重鏈，位于50.0 kD處，純度較高，濃度較大，無(wú)雜蛋白，抗體純化效果較好。

1.3.5 免疫膠體金試紙主要反應(yīng)條件的確定

1.3.5.1 膠體金的制備

用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置于磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，每100 ml 0.01%氯金酸加入2 ml、1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至液體呈紅色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水，用肉眼觀察，可見(jiàn)膠體金溶液外觀呈酒紅色，均勻度較好、無(wú)雜質(zhì)、透明度較高。用電鏡掃描，膠體金顆粒的粒徑為20 nm左右，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 膠體金電鏡掃描

1.3.5.2 膠體金標(biāo)記抗體

在磁力攪拌下，用0.1 mol/l碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按每毫升膠體金50～100 μg抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入硝基呋喃類藥物單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30 min，加入10%BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置30 min。12 000 r/min，4℃離心30 min，棄上清液，沉淀用含有0.1%牛血清白蛋白，0.08%吐溫-80和0.3%吡咯烷酮的復(fù)溶緩沖液洗滌2次，用體積為初始膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，得到的金標(biāo)抗體溶液，置4℃?zhèn)溆?。將羊抗鼠二抗點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，直接與金標(biāo)抗體反應(yīng)，可見(jiàn)有明顯的粉紅色斑點(diǎn)，表明金標(biāo)抗體有活性。

1.3.5.3 硝酸纖維素膜的選擇

將抗原適當(dāng)稀釋后通過(guò)點(diǎn)樣方式分別包被在milipore90、milipore135和mdi70三種硝酸纖維素膜上，經(jīng)干燥、組裝試紙條后，發(fā)現(xiàn)不同孔徑及廠家的硝酸纖維素膜點(diǎn)樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，milipore135顯色最深，milipore90和 mdi70差別不大，milipore135層析速度較慢，不利于樣本層析，milipore90試劑展開(kāi)速度較milipore135快，但不及mdi70。mili?pore90與mdi70上檢測(cè)線顯色情況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。綜合層析速度與顯色情況，三種硝酸纖維素膜中，mdi70更符合檢測(cè)要求。

1.3.5.4 結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊的選擇

分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質(zhì)材料作為結(jié)合墊及樣品墊組裝試紙條，在結(jié)合墊處滴加2 μl、10%的金標(biāo)抗體，滴加70 μl的陰性飼料樣品液，QXLM對(duì)飼料樣本的吸收能力較好，層析速度較快且顯色較深，故選擇QXLM作為結(jié)合墊和樣品墊。吸水墊選擇吸水能力較好，質(zhì)地均勻的Cotton linters300，厚度2.59。

1.3.5.5 結(jié)合墊的包被

將結(jié)合墊浸泡于pH值7.2，含有5%牛血清白蛋白，0.05 mol/l磷酸鹽緩沖液中浸濕1 h，37℃烘2 h；用劃膜儀將金標(biāo)抗體包被在結(jié)合墊上，每1 cm結(jié)合墊包被0.01 ml金標(biāo)抗體，置于37℃環(huán)境中60 min后取出，置于4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.6 樣品吸收墊的處理

將樣品吸收墊置于pH值7.2，含2%小牛血清，1%活性劑，0.2 mol/l磷酸鹽緩沖液浸泡2 h，37℃環(huán)境中2 h后備用。

自以為瞞天過(guò)海，常常暗自慶幸，他哪里想到，他的一切舉動(dòng)盡在妻子掌握之下。那么她拍這些照片要干什么呢？其動(dòng)機(jī)似乎不完全是為了拿到自己背叛的證據(jù)。既然有了確鑿的證據(jù)，為什么遲遲不向自己攤牌呢？仔細(xì)回味，妻子似乎沒(méi)什么反常??？她怎么會(huì)如此鎮(zhèn)定？看來(lái)他低估了妻子的能力，低估了妻子的心機(jī)。

1.3.5.7 硝酸纖維素膜的處理與包被

用pH值7.2，0.01 mol/l磷酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋到1mg/ml,用劃膜儀將其包被于硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(T線),包被量為1 μl/cm；用pH值7.2,0.01 mol/l磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠二抗稀釋到1mg/ml，用劃膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線（C線），包被量為1 μl/cm。

1.3.5.8 包被原包被時(shí)間的確定

在硝酸纖維素膜上包被抗原后，置于37℃烘箱中干燥，時(shí)間設(shè)置為30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h，待滿足干燥時(shí)間后，同時(shí)對(duì)陰性飼料樣本進(jìn)行檢測(cè)，從節(jié)約時(shí)間及成本考慮，選擇包被抗原的硝酸纖維素膜在37℃干燥8 h。

1.3.5.9 金標(biāo)抗體干燥條件的確定

用pH值7.2，0.01 mol/l磷酸鹽緩沖液將金標(biāo)抗體稀釋到1∶2，取5 μl涂布在結(jié)合物墊上，分別置于室溫、37 ℃條件下干燥，時(shí)間設(shè)置為10、20、30、60、120 min，結(jié)合墊在室溫、37℃下干燥時(shí)間大于30 min時(shí)檢測(cè)結(jié)果差異不顯著，為減少外界因素對(duì)試驗(yàn)的影響，最終選擇37℃下干燥60 min作為結(jié)合墊干燥條件。

1.3.5.10 檢測(cè)線（T）、質(zhì)控線（C）包被濃度及線寬的確定

利用已確定包被液將抗原與羊抗鼠二抗分別進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，并制備成試紙條檢測(cè)，綜合考慮陰性顯色程度與陽(yáng)性樣本添加測(cè)試確定在硝酸纖維素膜上的抗原濃度為0.09mg/ml，線寬為0.12 μl/cm，羊抗鼠二抗?jié)舛葹?.13mg/ml，線寬為1.0 μl/cm。

試紙條組裝按照常規(guī)檢測(cè)試紙條組裝模式[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料樣本的前處理

稱取(1.0±0.05)g飼料樣品至聚苯乙烯離心管中，加入5 ml、50%甲醇水溶液，渦動(dòng)，靜置，取上清液用于檢測(cè)。

2.2 試紙條技術(shù)指標(biāo)的測(cè)定

2.2.1 試紙條檢測(cè)限

在空白飼料樣本中添加0、2.5、5、10 μg/kg的呋喃唑酮，0、1、3、6 μg/kg的呋喃它酮，0、1、2、4 μg/kg的呋喃西林，0、1、2、4 μg/kg的呋喃妥因，取試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次。

對(duì)呋喃唑酮的測(cè)試結(jié)果為：滴試0、2.5 μg/kg濃度時(shí)，試紙條上顯示出肉眼可見(jiàn)的兩條紅色條線，呈陰性，當(dāng)?shù)卧?、10 μg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)試紙條檢測(cè)線不顯色，呈陽(yáng)性，表明，本試紙條對(duì)呋喃唑酮的檢測(cè)限為5 μg/kg；

對(duì)呋喃它酮的測(cè)試結(jié)果為：滴試0、1 μg/kg濃度時(shí)，試紙條上顯示出肉眼可見(jiàn)的兩條紅色條線，呈陰性，當(dāng)?shù)卧?、6 μg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)試紙條檢測(cè)線不顯色，呈陽(yáng)性，表明，本試紙條對(duì)呋喃它酮的檢測(cè)限為3 μg/kg；

對(duì)呋喃西林的測(cè)試結(jié)果為：滴試0、1 μg/kg濃度時(shí)，試紙條上顯示出肉眼可見(jiàn)的兩條紅色條線，呈陰性，當(dāng)?shù)卧?、4 μg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)試紙條檢測(cè)線不顯色，呈陽(yáng)性，表明，本試紙條對(duì)呋喃西林的檢測(cè)限為2 μg/kg；

對(duì)呋喃妥因的測(cè)試結(jié)果為：滴試0、1 μg/kg濃度時(shí)，試紙條上顯示出肉眼可見(jiàn)的兩條紅色條線，呈陰性，當(dāng)?shù)卧?、4 μg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)試紙條檢測(cè)線不顯色，呈陽(yáng)性，表明，本試紙條對(duì)呋喃妥因的檢測(cè)限為2 μg/kg。

2.2.2 試紙條假陽(yáng)性率的測(cè)定

取空白飼料（不含有硝基呋喃藥物）樣本50份，將飼料樣本前處理后用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定2次，結(jié)果有1份試紙條的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，試紙條檢測(cè)飼料樣本的假陽(yáng)性率為2%。

2.2.3 試紙條假陰性率的測(cè)定

取陽(yáng)性飼料（呋喃唑酮含量≥5 μg/kg）樣本50份，陽(yáng)性飼料（呋喃它酮含量≥3 μg/kg）樣本50份，陽(yáng)性飼料（呋喃西林含量≥2 μg/kg）樣本50份，陽(yáng)性飼料（呋喃妥因含量≥2 μg/kg）樣本50份，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定2次，結(jié)果試紙條的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,試紙條檢測(cè)飼料樣本的假陰性率為0。

2.2.4 實(shí)際樣本的試紙條檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜[12]檢測(cè)結(jié)果的比較

采集50份飼料樣本，每種稱取1 g于離心管中，加50%的甲醇水溶液10 ml，渦動(dòng)，靜置，取上清液檢測(cè)。先用本實(shí)驗(yàn)研制試紙條進(jìn)行初篩，然后用高效液相色譜法進(jìn)行復(fù)核。試紙條檢測(cè)結(jié)果表明50份飼料樣本中43份為陰性，其余7份為陽(yáng)性；試紙條檢測(cè)結(jié)果和高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率為100%。

2.2.5 保存性實(shí)驗(yàn)

將制作好的試紙條置于鋁箔袋中，加干燥劑密閉包裝，分別置于4℃、37℃、室溫(20～25 ℃)條件下，其中置于4℃和室溫條件的試紙條每隔7 d取出兩組，置于37℃每天取出兩組,分別檢測(cè)陰性飼料樣本和陽(yáng)性飼料樣本（含有2 μg/kg的呋喃西林）。觀察檢測(cè)線的有無(wú)，顏色深淺及玻璃纖維素膜上金標(biāo)抗體的釋放程度，4℃和室溫條件下的保存試驗(yàn)持續(xù)3個(gè)月，37℃條件下保存試驗(yàn)持續(xù)7 d。確定試紙條的保存條件是置于鋁箔袋中抽真空、加干燥劑室溫密閉保存。

3 小結(jié)

硝基呋喃類藥物作為抗生素，其殘留通過(guò)食物鏈嚴(yán)重危害人體健康，各國(guó)都對(duì)其殘留做出限量要求。本研究制備了硝基呋喃類藥物單克隆抗體，建立了硝基呋喃類藥物膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條方法。結(jié)果表明，該試紙條檢測(cè)方法對(duì)飼料中呋喃唑酮的檢測(cè)限為5 μg/kg，對(duì)飼料中呋喃它酮的檢測(cè)限為3 μg/kg，對(duì)飼料中呋喃西林的檢測(cè)限為2 μg/kg，對(duì)飼料中呋喃妥因的檢測(cè)限為2 μg/kg；本方法試紙條對(duì)飼料樣本檢測(cè)的假陽(yáng)性率為2%，假陰性率為0；與儀器方法檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性復(fù)核率為100%；單個(gè)樣本的檢測(cè)時(shí)間僅需10 min。本試紙條產(chǎn)品，檢測(cè)時(shí)不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，樣本前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，檢測(cè)效率高，適合于大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)篩查。

[1]賈濤.高效液相色譜法檢測(cè)飼料中的硝基呋喃類藥物[J].檢測(cè)分析,2011,16:33-37.

[2]祝偉霞,劉亞鳳,梁偉.動(dòng)物性食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測(cè)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(2):99-102.

[3]曹瑩,張文剛,黃士新,等.飼料中4種硝基呋喃類藥物的檢測(cè)方法研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2008,10（S2）:32-34.

[4]王蕾,鮑恩東.飼料中硝基呋喃類藥物高效液相色譜檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,16（2）:125-132.

[5]宋凱,肖桂英,姜橋,等.高效液相色譜法同步測(cè)定飼料及獸藥中4種硝基呋喃類藥物[J].糧食與飼料工業(yè),2010,3:49-51.

[6]徐英江,任傳博,田秀慧,等.海產(chǎn)品中硝基呋喃類原藥的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010,4:327-330.

[7]McCracken R J,Kennedy D G.Determination of furazolidone in animal feeds using liquid chromatography with UV and thermospray mass spectrometric detection[J].Journal of Chromatography A,1997,771:349-354.

[8]Jorge Barbosa,Sara Moura,Rita Barbosa,Determination of nitrofu?rans in animal feeds by liquid chromatography-UV photodiode ar?ray detection and liquid chromatography-ionspray tandem mass spectrometry[J].Analytica chimica acta,2007,586(1):359-365.

[9]李軍,張會(huì)彩,劉聚祥,等.酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)動(dòng)物飼料中呋喃唑酮[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009,45（8）:85-86.

[10]蔣宏偉.酶聯(lián)免疫技術(shù)在動(dòng)物產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物殘留檢測(cè)的應(yīng)用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,5:53-55.

[11]魏文平,龔振明.膠體金免疫層析法檢測(cè)獸藥殘留的原理和方法[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007，8:41-43.

[12]農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告-8-2010.飼料中硝基呋喃類藥物的測(cè)定高效液相色譜法農(nóng)業(yè)部[S].