陳青，陳曉，孫俊，曾容，胡素泉，李岷，劉維達

香菇多糖（lentinan，LNT）作為免疫調(diào)節(jié)劑已在我國、日本、美國及東南亞各國等臨床上用于腫瘤治療，該多糖是菌體細胞壁中分離的主鏈為1→3 連接鍵型、枝鏈為 1→6 鍵型的 β-D-葡聚糖[1-3]。國外學者及我們的研究均表明樹突狀細胞相關 C 型凝集素 1（Dectin-1）是識別 β-葡聚糖、激活免疫反應的最主要模式識別受體[4-6]。本研究旨在研究香菇多糖能否依賴人單核/巨噬細胞系THP-1 細胞表達的 Dectin-1 介導來誘導產(chǎn)生IL-12。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及主要試劑 香菇多糖購自南京康海藥業(yè)有限公司；人 THP-1 細胞株購自美國模式菌種收藏中心（ATCC）；IL-12 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自美國 R&D Systems 公司；SuperScript III 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為美國 Invitrogen 公司產(chǎn)品；Dectin-1抑制劑昆布多糖（laminarin）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 Smart Cycler System II 型實時熒光定量 PCR 儀為美國 Cepheid 公司產(chǎn)品；Bio-rad 680 型全自動酶標儀為美國 Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人 THP-1 單核細胞在含 10%小牛血清、1% 青鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)、傳代。接種 2 × 106個細胞于 6 孔培養(yǎng)板，血清饑餓 16 h 后，與刺激物共培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光 RT-PCR THP-1 細胞與 LNT（終濃度 5 μg/ml）共培養(yǎng)，并設培養(yǎng)基空白對照組。Trizol 法抽提總 RNA，取 2 μg 總 RNA 按SuperScript III 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書合成cDNA。采用 Syber green 法對目的基因進行擴增，相關基因引物如下[5]：

Dectin-1：正向序列 5′ TCAATGTAAGAGGAA GGGTG 3′；反義序列 5′ GCCAAGCTCTCTAAAC ATTT 3′。

IL-12p40：正向序列 5′ CCACATTCCTACTTC TC 3′；反義序列 5′ GTCTATTCCGTTGTGTC 3′。

IL-12p35：正向序列 5′ ACCAGGTGGAGTTC AAGACC 3′；反義序列 5′ TGGCACAGTCTCACT GTTGA 3′。

GAPDH：正向序列 5′ CGGATTTGGTCGTATT GGG 3′；反義序列 5′ CTCGCTCCTGGAAGATGG 3′。

以 2?ΔΔCT法計算目的基因的變化水平，ΔCT=目的基因 CT值 － 內(nèi)參照（GAPDH）CT值；某一樣品的 ΔΔCT= 某一樣品 ΔCT－ 最低表達的樣品的 ΔCT。LNT 刺激后 1、6、24 h 分別檢測Dectin-1 的 mRNA 水平；刺激后 1、4、6 h 分別檢測 IL-12p35、IL-12p40 的 mRNA 水平。

1.2.3 ELISA 法測定 IL-12 含量 THP-1 細胞與終濃度分別為 10、5、1 μg/ml 的 LNT 共培養(yǎng) 6 h 后；收集上清液，按照試劑盒說明書檢測上清液中 IL-12 的含量。用 laminarin 100、50 μg/ml 分別預處理 THP-1 細胞 30 min，再予 5 μg/ml 的LNT 刺激；檢測上清液中 IL-12 的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 LNT 對 Dectin-1 的 mRNA 表達水平的影響

LNT 作用 THP-1 細胞后 1、6、24 h，LNT組、培養(yǎng)基對照組的 Dectin-1 的 mRNA 水平結果見圖 1。上述 3 個不同時刻，LNT組的 Dectin-1 的mRNA 水平均明顯高于對照組（*P ＜ 0.001）。

圖1 LNT 對 Dectin-1 的 mRNA 表達水平的影響Figure 1 The effect of LNT on the level of Dectin-1 mRNA

圖2 LNT 對 IL-12p35 mRNA 水平的影響Figure 2 The effect of LNT on the level of IL-12p35 mRNA

2.2 LNT 對 IL-12p35、IL-12p40 mRNA 表達水平的影響

LNT 作用 THP-1 細胞 1、4、6 h 后，IL-12p35、IL-12p40 的 mRNA 表達水平的變化情況見圖 2 和圖 3。與培養(yǎng)基對照組比較，LNT組IL-12p35、IL-12p40 的 mRNA 水平在刺激不同時間后均顯著增高（*P ＜ 0.0001）。

圖3 LNT 對 IL-12p40 mRNA 水平的影響Figure 3 The effect of LNT on the level of IL-12p40 mRNA

2.3 LNT 對 IL-12 蛋白分泌的影響

不同濃度組（1、5、10 μg/ml）的 LNT 作用THP-1 細胞 6 h，上清液中 IL-12 蛋白含量結果見圖 4。三組含量均明顯高于培養(yǎng)基對照組（*P ＜0.0001）。

圖4 LNT 對 IL-12 蛋白分泌的影響Figure 4 The effect of LNT on the secretion of IL-12 protein

2.4 Dectin-1 抑制劑 laminarin 對 LTN 誘導IL-12 分泌的影響

不同濃度 laminarin（100、50 μg/ml）預處理THP-1 細胞后，再予 5 μg/ml LNT 刺激，檢測上清液中 IL-12 的含量，結果見圖 5。與 LNT組比較，laminarin 預處理組 IL-12 分泌量分別降低了 51% 和26%，差異有統(tǒng)計學意義（**P ＜ 0.0001和*P ＜ 0.01）。

圖5 Dectin-1 抑制劑 laminarin 對 LTN 誘導 IL-12 分泌的影響Figure 5 The effect of dectin-1 inhibitor laminarin on the secretion of IL-12 induced by LNT

3 討論

香菇多糖已被證實具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，能激活巨噬細胞、LAK 細胞、NK 細胞等固有免疫細胞[1]。有研究發(fā)現(xiàn)可通過誘導消化道腫瘤患者上調(diào) Th1 型細胞因子分泌（如 IL-2、IL-12）并抑制 Th2 型細胞因子分泌（如 IL-4）來影響獲得性免疫反應[3]。而對于免疫細胞是如何識別 LNT 而誘發(fā)相應免疫反應的相關機制尚未充分揭示。近來發(fā)現(xiàn) Dectin-1 作為一種 C 型凝集素樣受體家族的成員，是識別 β-1,3 和（或）β-1,6 葡聚糖的高親和性關鍵受體，分布于樹突狀細胞、單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、某些亞類的 T 淋巴細胞等免疫細胞以及上皮、角膜和皮膚等組織[4-6]。本研究旨在初步明確人單核細胞系 THP-1 細胞能否通過所表達的 Dectin-1 來識別香菇多糖并誘導免疫反應。

研究發(fā)現(xiàn) THP-1 細胞上 Dectin-1 的 mRNA表達水平在 LNT 作用后出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，與無刺激細胞對照組比較，在作用 1 h 后，該受體 mRNA水平出現(xiàn)升高，6 h 達到峰值，在作用 24 h 后仍可出現(xiàn)較高水平的表達，結果提示 LNT 在一定范圍內(nèi)能以時間-效應方式上調(diào) THP-1 細胞Dectin-1 的 mRNA 表達。

IL-12 是由 p40 和p35 兩個亞基構成的異源二聚體，分子量約為（70～75）× 103，編碼 p35 和p40 的基因位于不同的染色體，轉(zhuǎn)錄由各自的啟動子和增強子調(diào)控，具有免疫活性的 IL-12p70 需要兩亞基共同表達后聚合而成，主要由單核巨噬細胞、DC 細胞等分泌[7]。Murata 等[8]報道 LNT 能誘導小鼠腹腔巨噬細胞分泌 IL-12 蛋白，李丹等[9]采用 ELISA 法檢測 LNT 體外與人 PBMC 細胞作用后 IL-12 水平顯著增加。本研究與上述研究結果一致，發(fā)現(xiàn) LNT 刺激 THP-1 單核細胞后，能顯著促進 IL-12 的分泌，且隨 LNT 濃度增高而升高，呈現(xiàn)劑量依賴方式。LNT 還能上調(diào) IL-12p35和p40 兩個亞基的 mRNA 表達，并呈現(xiàn)時間-效應關系。

THP-1 細胞預先與不同濃度的 Dectin-1 抑制劑 laminarin 共孵育后，再應用 LNT 刺激，發(fā)現(xiàn)與 laminarin 未預處理組比較，分泌 IL-12 的含量明顯降低，且與 laminarin 的濃度相關，當濃度升高，釋放 IL-12 的含量則隨之降低。這進一步表明LNT 誘導 THP-1 細胞分泌釋放 IL-12 的能力是與 Dectin-1 對其識別和結合有關。

IL-12 能促進 CD4+ 細胞向 Th1 型漂移而增強免疫反應，Th1 細胞進而誘導 CTL、NK 和巨噬細胞的增生和活化，共同參與腫瘤抑制反應[10]。本研究結果初步表明人單核巨噬細胞系 THP-1 細胞能依賴所表達的 Dectin-1 識別香菇多糖而誘導分泌 IL-12。這為進一步揭示香菇多糖參與機體抗腫瘤免疫反應的機制提供理論依據(jù)。在今后研究中，還要對 Dectin-1 相關的下游信號傳導通路，包括脾臟酪氨酸激酶（Syk）-蛋白酶募集域 9（CARD9）信號通路及絲氨酸-蘇氨酸激酶-1（Raf-1）信號通路[11]在此效應中的作用進行深入探討。

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